镉(Cd)是一种环境污染元素,易通过各种途径进入动物或人机体内并蓄积,对体内各脏器都有毒性,并能破坏血脑屏障进入脑部,是神经退行性疾病的重要诱因之一。镉可诱导神经细胞自噬,自噬过度或自噬过程被抑制都会造成神经细胞损伤,AMPK-ULK1自噬信号通路是一条重要调控路径,其ventriculostomy-associated infection与神经损伤有密切关系,寻找有效保护剂解决镉诱导的神经损伤已成为目前的热点问题。绿原酸是一种多酚,可通过血脑屏障,具有神经保护作用,但其是否可缓解镉致鸡大脑皮质神经元损伤和AMPK-ULK1通路介导的自噬尚未见报道。本研究用雌性三黄鸡建立体内模型,用鸡大脑皮质神经元建立体外模型,体内和体外试验结合探究AMPK-ULK1通路介导的自噬在镉致鸡大脑皮质神经元损伤中的作用及绿原酸的保护效应,为临床上使用绿原酸缓解镉的神经毒性提供理论依据。1.绿原酸缓解镉致鸡大脑皮质神经元损伤和AMPK-ULK1通路激活为探究绿原酸是否可缓解镉致鸡大脑皮质神经元损伤和AMPK-ULK1通路激活,将72只雌性三黄鸡,预饲7 d后分为6组:对照组(Control)、镉组(Cd)、200 mg/kg 绿原酸组(CGA200)、400 mg/kg 绿原酸组(CGA400)、200 mg/kg绿原酸与镉联合组(CGA200+Cd)、400 mg/kg绿原酸与镉联合组(CGA400+Cd)。Cd组在每千克基础日粮中添加70 mg氯化镉拌饲,CGA200组在每千克基础日粮中添加200 mg绿原酸拌饲,CGA400组在每千克基础日粮中添加400 mg绿原酸拌饲,CGA200+Cd组在每千克基础日粮中添加200 mg绿原酸和70 mg氯化镉拌饲,CGA400+Cd组在每千克基础日粮中添加400 mg绿原酸和70 mg氯化镉拌饲,持续30 d。试验结束后剖杀采集鸡大脑皮质,火焰原子吸收光谱法检测镉含量,HE染色法观察病理损伤,透射电子显微镜观察超微结构损伤、自噬体和自噬溶酶体,实时荧光定量PCR法检测AMPK-ULK1通路(AMPK、ULK1)和自噬(Beclin 1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62)相关基因转录水平,免疫印迹法检测AMPK-ULK1通路(p-AMPK、AMPK、p-ULK1、ULK1)和自噬(ATG5、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62)相关蛋白表达水平。结果表明:①200 mg/kg和400 mg/kg绿原酸均显著降低了镉暴露鸡大脑皮质镉含量(P<0.05)。②200 mg/kg和400 mg/kg绿原酸均可缓解镉致鸡大脑皮质病理损伤。③200 mg/kg和400 mg/kg绿原酸缓解了镉致鸡大脑皮质神经元超微结构损伤。④200 mg/kg和400 mg/kg绿原酸缓解了镉致鸡大脑皮质神经元内自噬体累积。⑤200 mg/kg和400 mg/kg绿原酸显著抑制了镉致鸡大脑皮质神经元AMPK-ULK1通路激活(P<0.05)。⑥200mg/kg和400mg/kg绿原酸显著抑制了镉致鸡大脑皮质神经元自噬相关基因转录和蛋白表达水平升高(P<0.05)。以上结果说明绿原酸D-Lin-MC3-DMA小鼠缓解了镉致鸡大脑皮质神经元损伤和AMPK-ULK1通路激活。2.绿原酸缓解镉致鸡大脑皮质神经元损伤和AMPK-ULK1通路介导的自噬为探究绿原酸对镉致鸡大脑皮质神经元损伤和AMPK-ULK1通路介导的自噬的保护效应,分离、培养鸡大脑皮质神经元并鉴定其纯度后,用不同浓度(0、2.5、5、10、20、40 μM)CdCl2 处理 12 h;不同浓度(0、5、10μM)Compound C或不同浓度(0、25、50、75、100 μM)绿原酸单独或者联合10μM CdCl2处理12 h;10 μM Compound C或75 μM绿原酸单独或者联合10μM CdCl2处理12 h。CCK-8法检测神经元活力,实时荧光定量PCR法检测AMPK-ULK1 通路(AMPK、ULK1)和自噬(Beclin 1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62)相关基因转录水平,免疫印迹法检测AMPK-ULK1通路(p-AMPK、AMPK、p-ULK1、ULK1)和自噬(ATG5、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62)相关蛋白表达水平。结果表明:①9胚龄的SPF鸡胚可用于分离培养鸡大脑皮质神经元,纯度在84%左右。②10 μM、20 μM、40 μMCdCl2致神经元活力显著下降(P<0.05);10μMCdCl2可显著提高鸡大脑皮质神经元AMPK、ULK1基因转录水平(P<0.05);10 μM Compound C可显著缓解镉致鸡大脑皮质神经元活力下降(P<0.05)。③10 μM Compound C可显著抑制镉致鸡大脑皮质神经元自噬相关蛋白表达水平升高(P<0.05)。④75μM绿原酸可显著抑制镉致鸡大脑皮质神经元活力下降(P<0.05)。⑤75 μM绿原酸显著抑制镉致鸡大脑皮质神经元AMPK-ULK1通路相关基因转录和蛋白磷酸化水平升高(P<0.05),100 μM绿原酸可显著抑制镉致鸡大脑皮质神经元AMPK-ULK1通路相关基因转录水平升高(P<0.05)。⑥75μM确认细节绿原酸显著抑制镉致鸡大脑皮质神经元自噬相关基因转录和蛋白表达水平升高(P<0.05)。以上结果说明,绿原酸缓解了镉致鸡大脑皮质神经元损伤和AMPK-ULK1通路介导的自噬。综上所述,本研究发现镉可致鸡大脑皮质神经元损伤,并能通过AMPK-ULK1通路诱导鸡大脑皮质神经元自噬,绿原酸可缓解镉致鸡大脑皮质神经元损伤和AMPK-ULK1通路介导的自噬。