绵羊副流感病毒3型(Ovine parainfluenza virus type 3,OPIV3)是引起羊呼吸道疾病综合征(Ovine respiratory disease complex,ORDC)的主要病原之一。OPIV3感染羊后出现发热、流涕、咳嗽等症状,病羊如果继发细菌感染出现肺炎等情况。该病严重影响规模化羊养殖业的发展,造成重大经济损失。目前,国内外对OPIV3的研究较少,且没有商品化OPIV3血清学检测试剂盒。因此,建立一种OPIV3血清学检测方法至关重要。N蛋白是病毒的核衣壳蛋白,具有良好的免疫原性。本研究利用大肠杆菌原核表达系统,构建了OPIV3重组蛋白p ET32a(+)-N表达载体,成功表达N蛋白,利用重组蛋白建立了绵羊副流感病毒3型抗体诊断方法,并制备出针对OPIV3 N蛋白的单克隆抗体,为绵羊副流感病毒3型的血清学流行病学调查及其他诊断方法建立奠定了基础。1.N蛋白的原核表达本研究参考绵羊副流感病毒3型病毒N基因序列(Gen Bank登录号:MT756864),利用生物信息学软件DNAstar进行优势抗原表位筛选,将筛选得到的优势抗原表位进行同源性分析,结果显示,其与已报道人副流感病毒3型病毒(Human armed forcesparainfluenza virus type3,HPIV3)、牛副流感病毒3型病毒(Bovine parainfluenza virus type3,BPIV3)和山羊副流感病毒3型病毒(Caprine parainfluenza virus type3,CPIV3)的序列同源性最高分别为60%、65.7%和96.2%。将N基因片段连接至原核表达载体p ET32a(+)上,得到重组质粒p ET32a(+)-N。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态菌株中,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE与Western blot试验结果显示,重组N蛋白诱导表达成功,其分子量约为46k D。2.OPIV3间接ELISA抗体检测方法的建立以纯化的重组蛋白为包被抗原,建立了OPIV3间接ELISA抗体检测方法。并确定了间接ELISA法的最佳制备条件:抗原包被浓度为0.05μg/m L,包被条件为4℃,16h;最佳封闭液为5%BSA,最佳封闭条件为37℃1.5h;待测血清的最佳稀释度为1:200,最佳血清作用时间为0.5h;酶标抗体的最佳稀释度为1:4000,酶标抗体的最适反应时间为1h;最佳底物显色时间为15min。研究了该ELISselleck合成A方法的特异性、灵敏度和重复性。结果显示,该方法具有良好的特异SAG性,与羊常见病原溶血性曼氏菌、羊痘病毒和绵羊肺炎支原体阳性血清均无特异性反应;试剂盒具有良好的敏感性,绵羊副流感病毒阳性质控血清稀释至1:1600仍能检出;同时我们进行批次间和批次内的验证,结果显示其变异系数小于10%。3.单克隆抗体制备及鉴定用纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠以产生小鼠抗His-N单克隆抗体。将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(S/P20)融合,通过间接ELISA检测阳性杂交瘤。其细胞培养上清和小鼠腹水ELISA效价分别为2~7和10~5,间接ELISA、Western Blot和IFA试验显示出良好的反应性和特异性。抗体亚类鉴定为Ig G2a。综上所述,本研究成功表达OPIV3-N重组蛋白,利用重组蛋白制备出一株单克隆抗体,并初步建立了间接ELISA抗体检测方法。