高脂血症(Hyperlipidemia,HLP)是一种慢性代谢紊乱疾病,其特征是机体中脂质或脂蛋白的循环水平升高。机体中血脂异常会进一步导致动脉粥样硬化、心血管疾病的发生发展。血脂异常主要是由生活中不良饮食以及其他疾病引起的。目前常用于治疗HLP的药物有他汀类药物、胆汁酸螯合剂、贝丁酸类和烟酸类药物等,但会引起严重的副作用或不良反应,如肌肉疾病、肝损伤、上腹部窘迫和可逆性肝功能障碍。因此,迫切需要开发一种副作用较小、效果良好的策略来治疗HLP。食用真菌具有丰富的营养成分,如多糖、蛋白质、维生素等,长期食用MK-1775 IC50将改善人体健康。食用真菌的提取物或粉末常被用于预防、缓解、治疗某些疾病或者提供均衡饮食。此外,食用真菌多糖具有修复肠道屏障能力、改善肠道微生物群结构与组成,并且被微生物产生的相关酶降解为易于吸收的小分子物质,进而改善机体代谢。粗毛纤孔菌(Inonotus hispidus(Bull.:Fr.)P.Kurst,IH),别名粗毛褐孔菌、粗毛黄孔菌,属于担子菌亚门纤孔菌属的食用真菌。国内外学者的研究发现,IH具有多种生物活性成分,例如多糖、多酚、萜类、甾体等,并初步展现出降血脂、降血糖、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抑菌抗病毒等多种药理活性。虽然IH子实体中多糖含量较为丰富,但是对其多糖的分离纯化方法建立、结构表征以及体内降血脂功效尚未见系统性报道。因此,在本研究中,我们利用高脂饮食(HFD)诱导的HLP小鼠模型来明确IH及其分离纯化多糖IHP3的降血脂功效及相关机制,为充分挖掘并利用IH资源提供了实验与理论支撑。具体的研究内容如下:1、IH子实体对HLP小鼠降血脂的调控作用研究。首先经过8周的HFD喂养建立HLP小鼠模型,然后经过8周的IH给药治疗能够显著抑制HLP小鼠体重的增长及空腹血糖水平的升高,扭转了肝脏和三种脂肪(腹股沟、附睾和肾周)的病理状态,并显著降低了血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和瘦素(LEP)的表达水平,增加了高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的表达水平。同时,IH通过调节肝脏和血清中肝损伤指标如谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、炎症因子如白介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF-α)、纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)以及氧化应激相关因子如活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的水平来减轻肝脏损伤进而达到肝脏保护的目的。此外,结合肠道微生物群分析以及血清脂质组学分别发现,IH明显调节了肠道微生物群组成,改善了不同分类水平的微生物群的相对丰度,并调节了血清中的脂质水平https://www.selleck.cn/products/vx-661.html。最后通过Western blot的结果证实,IH能够调节核因子E2相关因子(Nrf2)/核因子κB(NF-κB)信号通路来介导炎症以及氧化应激,进而调控肠道微生物群,改善机体血脂水平,达到降血脂的功效。2、IH子实体多糖分离纯化以及结构表征。在提取温度90℃、提取时间3h、提取料液比1:30、提取次数为2次的条件下对IH子实体进行多糖提取。将所获得的提取液进行除蛋白、透析、浓缩、醇沉以及冻干等过程后获得粗毛纤孔菌粗多糖IHP,得率为0.81%。IHP的总糖含量为51.30%。接着,利用阴离子交换层析柱DEAE Bestarose FF对IHP进行两次的分离纯化,得到纯化多糖IHP1。再利用凝胶过滤层析柱Sephacryl~(TM) S-400对IHP1进行分子排阻纯化获得纯化多糖IHP2,最后利用凝胶过滤层析柱Finedex 200pg对IHP2进行分子排阻纯化,获得了分子量相对集中且均一性良好的纯化多糖IHP3。利用高效液相色谱(HPLC)、凝胶渗透色谱(GPC)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、紫外分析(UV)、核磁共振(NMR)以及扫描电子显微镜(SEM)等技术分别对IHP3的单糖组成、多糖分子量、单糖之间的糖苷键连接类型、多糖的分支结构与分子构象等进行表征。结果表明IHP3样品中几乎无核酸及蛋白质杂质,含有O-H、C=O以及C-O的伸缩振动吸收峰,由7种单糖组成,其单糖摩尔比为Gal:Fuc:Man:Glc-UA:Glc:Rha:Man-UA=48.84:21.85:17.88:5.93:5.46:0.03:0.01,表明IHP3主要是由Gal、Fuc和Man三种单糖构成。GPC检测结果显示出IHP3具有一个均匀单一的峰,分子量范围是10.00 k Da-27.48 k Da,占比为99.50%。IHP3的重均分子量(Mw)为19.16 k Da,多分散性指数(Mbinding immunoglobulin protein (BiP)w/Mn)为1.02,表明了IHP3的分子量较小,且具有良好的均一性。甲基化分析结果表示IHP3主要由10个糖苷片段组成,即T-Fucp,T-Manp,T-Glcp,2-Fucp,T-Galp,2-Manp,6-Manp,6-Glcp,6-Galp和2,6-Galp。最后,结合NMR分析结果推断出纯化多糖IHP3是杂多糖,主链结构主要是由→6)-α-D-Galp-(1→和→2,6)-α-D-Galp-(1→构成,在→2,6)-α-D-Galp-(1→糖残基的O-2位置存在支链结构。SEM结果表明IHP3由不规则的片状和条状的混合结构组成,大小不一形状各异,表面形态光滑,呈现无定型结构。3、IH子实体纯化多糖IHP3对HLP小鼠降血脂的调控作用研究。首先经过8周的HFD喂养建立HLP小鼠模型,然后经过4周的IHP3给药治疗能够显著抑制HLP小鼠体重的增长及空腹血糖水平的升高,扭转了肝脏和四种脂肪(腹股沟、附睾、肾周和肩胛)的病理状况及脏器指数,并显著降低了血清中LDL-C、TC和TG的表达水平,增加了HDL-C的表达水平。同时,IHP3通过抑制HLP小鼠肝脏和血清中AST和ALT表达水平来抑制肝脏损伤。此外,肠道微生物群代谢物分析的结果表明,IHP3给药能够显著上调4种代谢物如12(13)-环氧树脂-9z-十八碳烯酸和亚麻酸等,下调8种代谢物如γ-鼠胆酸、神经酰胺(d18:1/18:1(9Z))、D-核糖-1-磷酸以及12-酮基去氧胆酸等。其中亚麻酸与12(13)-环氧树脂-9z-十八碳烯酸呈现正相关,而神经酰胺(d18:1/18:1(9Z))与亚麻酸、12(13)-环氧树脂-9z-十八碳烯酸呈现负相关。肝脏蛋白组学分析结果表明,经过IHP3给药后小鼠肝脏蛋白表达显著上调的有22种,下调的有12种。对以上差异蛋白经过GO富集分析得出IHP3参与HLP小鼠肝脏急性期反应、急性炎症反应、补体激活等生物过程,并筛选出脂肪合成的关键酶乙酰辅酶A羧化酶(ACC1),及急性炎症反应蛋白触珠蛋白(Hp)、血清类粘蛋白(ORM1)和血清淀粉样蛋白(Saa1)。此外,IHP3能够通过抑制过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPARγ)的磷酸化来促进白色脂肪(WAT)褐化以及提高棕色脂肪(BAT)活性,进而有效改善HLP小鼠机体产热。最后通过酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫组织化学(IHC)以及Western blot结果分析,IHP3能够调控IL-17信号通路来改善炎症反应,进而调控HLP小鼠脂质水平,达到降血脂功效的作用。综上所述,本研究采用HFD喂养诱导的HLP小鼠模型明确了IH子实体降血脂功效与肠道微生物组成、氧化应激和炎症反应有关;明确了纯化多糖IHP3的Mw为19.155 k Da,其结构主链结构主要是由→[6)-α-D-Galp-(1→6)-α-D-Galp-(1]_n→和→[6)-α-D-Galp-(1→2,6)-α-D-Galp-(1]_n→构成,在→2,6)-α-D-Galp-(1→糖残基的O-2位置存在支链结构。其支链结构可能包括α-D-Manp-(1→,α-D-Manp-(1→6)-β-D-Manp-(1→,α-L-Fucp-(1→6)-β-D-Manp-(1→,α-D-Manp-(1→2)-α-L-Fucp-(1→6)-β-D-Manp-(1→;此外,进一步明确了IHP3能够通过调控IL-17信号通路来抑制HLP小鼠中炎症反应,抑制PPARγ磷酸化,促进WAT褐化和激活BAT活性,调节肠道微生物代谢的表达从而缓解高脂血症症状。因此,本研究为IH及其纯化多糖对HLP的治疗机制以及相关药物研发提供了理论基础。