实验目的:胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤之一,替莫唑胺是治疗胶质瘤的一线药物,尽管联合放疗取得了一定的效果,但胶质瘤患者的预后仍不理想,5年总生存率低于10%,因此亟需一种提高替莫唑胺治疗效果的新方法。Dickkopf-1(DKK1)是一种分泌型糖蛋白,在多种肿瘤组织中高表达,并与癌症患者的不良预后有关。明确DKK1是否拮抗了替莫唑胺的抗胶质瘤效果,是本研究需要解决的问题之一。穿心莲内酯是天然植物穿心莲的主要活性成分,脂溶性较好能穿过血脑屏障,有文献报道,穿心莲可通过抑制结直肠癌细胞中DKK1的表达增强5-氟尿嘧啶抗癌效果。明确穿心莲内酯能否增强替莫唑胺的抗胶质瘤活性,是本研究需要解决的主要问题。实验方法:1、探究替莫唑胺是否能够在体外诱导DKK1的表达:使用替莫唑胺5μM孵育四种胶质瘤细胞系(U87、U251、U-118MG和A172),采用Real-time PCR、Western blot实验在m RNA和蛋白水平检测DKK1的变化情况。2、探究替莫唑胺是否能够在体内诱导DKK1的表达:构建带有Luc标签的GL261细胞株,在C57BL/6J小鼠脑部建立胶质瘤原位模型,7天后利用动物活体成像系统检测模型是否构建成功,随后腹腔注射替莫唑胺(25 mg/kg)每天一次,持续14天,并在建模后14天及21天利用动物活体成像系统监测肿瘤变化情况。处死小鼠后,剥离出完整的脑组织,采用H&E染色检测小鼠脑部肿瘤大小;采用Real-time PCR、Western blot实验在m RNA和蛋白水平检测用药后小鼠肿瘤组织中DKK1的变化情况;采确认细节用免疫组织化学实验检测用药后小鼠肿瘤组织DKK1的表达。3、探究DKK1的过表达是否拮抗了替莫唑胺抗肿瘤效果:构建稳定过表达DKK1的U87和U251细胞株,通过MTT法检测DKK1对胶质瘤细胞增殖的影响;构建DKK1过表达和敲低的GL261-Luc细胞株,分别使用DKK1过表达和敲低的GL261-Luc细胞株建立小鼠胶质瘤原位模型,7天后利用动物活体成像系统检测模型是否构建成功,同时对DKK1敲低模型组腹腔注射替莫唑胺(25 mg/kg),每天一次,持续14天,并在建模后14天及21天利用动物活体成像系统监测过表达DKK1和敲低DKK1两个模型组肿瘤变化情况。处死小鼠后,剥离出完整脑组织,采用H&E染色检测小鼠脑部肿瘤大小。4、探究替莫唑胺是否通过上调EGFR表达促进DKK1的转录:替莫唑胺5μM孵育四种胶质瘤细胞系(U87、U251、U-118MG和A172),采用Real-time PCR、Western blot实验,在m RNA和蛋白水平检测EGFR的变化;转染过表达EGFR质粒,在m RNA和蛋白水平检测EGFR的变化;替莫唑胺孵育的同时,给予EGFR的抑制剂AG1478 10μM共同刺激胶质瘤细胞U87和U251,在m RNA和蛋白水平检测DKK1的变化;采用免疫组织化学实验检测替莫唑胺对小鼠肿瘤组织中EGFR表达的影响。5、探究EGFR下游PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路是否参与替莫唑胺介导的胶质瘤中DKK1转录:用替莫唑胺5μM孵育U87和U251细胞,采用Western blot实验,在蛋白水平检测p-AKT和p-ERK的变化;使用替莫唑胺孵育的同时,给予AKT的抑制剂MK2206 5μM和MEK抑制剂PD98059 20μM共同刺激胶质瘤细胞U87和U251,采用Real-time PCR、Western blot实验,在m RNA和蛋白水平检测DKK1的变化;采用免疫组织化学实验检测用药后小鼠肿瘤组织p-AKT和p-ERK的表达。6、探究穿心莲内酯能否抑制胶质瘤细胞中DKK1的表达,明确其机制并探究穿心莲内酯能否逆转替莫唑胺诱导的胶质瘤细胞中DKK1的转录:用穿心莲内酯50μM孵育四种胶质瘤细胞系(U87、U251、U-118MG和A172),在m RNA和蛋白水平检测DKK1,p-EGFR,EGFR的变化,在蛋白水平检测p-AKT和p-ERK的变化;替莫唑胺5μM和穿心莲内酯50μM共同作用U87和foetal immune responseU251两种胶质瘤细胞系,采用Real-time PCR、Western blot实验,在m RNA和蛋白水平检测DKK1的变化情况。7、建立动物胶质瘤原位模型探究穿心莲内酯能否通过抑制DKK1的表达增强替莫唑胺抗肿瘤作用:在C57BL/6J小鼠脑部尾状核区域接种GL261-Luc细胞建立小鼠胶质瘤原位模型,7天后利用动物活体成像系统检测模型是否构建成功,并在建模后14天及21天利用动物活体成像系统监测肿瘤变化情况;腹腔注射替莫唑胺25 mg/kg,每天一次;腹腔注射穿心莲内酯15 mg/kg,每2天一次,药物作用两周后,处死小鼠并剥离完整脑组织,采用H&E染色检测小鼠脑部肿瘤大小;采用Real-time PCR、Western blot实验在m RNA和蛋白水平检测用药后小鼠肿瘤组织中DKK1的变化情况;采用免疫组织化学实验检测用药后小鼠肿瘤组织DKK1的表达;同时为了探究联用后对小鼠生存期的影响,建立小鼠胶质瘤原位模型,7天后利用动物活体成像系统检测模型是否构建成功,腹腔注射替莫唑胺25 mg/kg,每天一次;腹腔注射穿心莲内酯15 mg/kg,每2天一次,药物作用两周后,记录小鼠死亡时间。实验结果:1、替莫唑胺能够促进胶质瘤细胞(U87、U251、U-118MG和A172)中DKK1m RNA和蛋白的表达。2、在小鼠原位胶质瘤模型中,替莫唑胺可显著上调小鼠脑部肿瘤组织中m RNA和蛋白水平的表达,免疫组织化学检测法也显示肿瘤组织中DKK1的表达显著上调。3、体外增殖实验发现,过表达DKK1后能够促进胶质瘤细胞(U87和U251)的生长;在小鼠原位胶质瘤模型中,过表达DKK1能够促进胶质瘤在体内的生长,而敲低DKK1不仅能够抑制胶质瘤的生长,还能增强替莫唑胺在体内的抗肿瘤效果。4、替莫唑胺孵育胶质瘤细胞(U87、U251、U-118MG和A172)相应时间后,EGFR的m RNA表达水平无显著变化,但EGFR的蛋白表达显著上调;在U87和U251细胞中过表达EGFR后,DKK1 m RNA和蛋白的表达水平显著上调,EGFR抑制剂AG1478能够逆转替莫唑胺引起的DKK1 m RNA和蛋白表达的上调;免疫组织化学结果显示替莫唑胺能够促进EGFR在小鼠脑肿瘤组织中的表达。5、替莫唑胺孵育胶质瘤细胞(PORCN抑制剂U87和U251)后,p-AKT和p-ERK的表达水平显著上调;使用AKT和MEK抑制剂MK2206和PD98059能够逆转替莫唑胺诱导的DKK1m RNA和蛋白水平的上调;免疫组织化学法发现替莫唑胺能够促进p-AKT和p-ERK在小鼠脑肿瘤组织中的表达。6、穿心莲内酯孵育胶质瘤细胞(U87和U251)相应时间后,DKK1 m RNA和蛋白表达水平均显著下调,但p-EGFR以及EGFR的蛋白表达水平无显著改变;同时穿心莲内酯能够抑制胶质瘤细胞(U87和U251)中p-AKT和p-ERK的表达;AKT抑制剂MK2206或MEK抑制剂PD98059均能够抑制胶质瘤细胞(U87和U251)中DKK1的表达;穿心莲内酯能够在m RNA和蛋白水平逆转替莫唑胺引起的DKK1表达上调。7、在原位胶质瘤模型中,动物活体成像系统以及H&E染色实验结果显示穿心莲内酯和替莫唑胺联用后能够增强替莫唑胺的抗肿瘤效果;穿心莲内酯和替莫唑胺联用可有效延长胶质瘤小鼠的中位生存期;穿心莲内酯能够逆转肿瘤组织中替莫唑胺引起的DKK1 m RNA和蛋白表达的上调,免疫组织化学检测法也证明穿心莲内酯能够抑制DKK1的表达并逆转替莫唑胺引起的DKK1上调。实验结论:替莫唑胺通过诱导EGFR的表达,进而激活其下游PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路,促进DKK1的转录表达;穿心莲内酯通过抑制PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路从而抑制DKK1的转录表达,进而增强替莫唑胺抗胶质瘤的活性。