由稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)引发的水稻稻瘟病是最重要的真菌病害之一,在其流行年份可使水稻减产50%,甚至绝产,给农业生产造成巨大的经济损失。稻瘟菌是研究水稻和病原菌互作机制的模式真菌。目前稻瘟菌侵染机制研究取得了一定进展,但是对于致病机制的了解仍有待加深,深入研究稻瘟菌的致病机制,可为稻瘟菌的防治奠定基础。本实验室在之前的研究中得到了一个不形成分生孢子梗、不产生分生孢子且失去水稻致病能力的突变体ΔTNP,通过转录组与全基因组分析,得到一系列在ΔTNP中表达量显著下调的未知功能基因,预测其可能参与稻瘟菌分生孢子发育和水稻致病调控,本研究以其中一个具有MerR家族成员PF-02341066化学结构特征的基因(MoMERR)为研究对象,利用分子遗传学和分子生物学技术研究MoMERR的生物学功能,主要结果如下:1.基于稻瘟菌MoMERR基因在分生孢子梗发育与侵染初期的高水平表达动态,MoMERR基因可能参与稻瘟菌的分生孢子形成和致病过程。对克隆的MoMERR全长c DNA序列进行生物信息学分析,发现MoMERR基因全长1425bp,位于稻瘟菌一号染色体上;有四个外显子,三个内含子,全长c DNA编码199个氨基酸残基的蛋白质,是一个未知功能蛋白。对其亚细胞定位进行预测,主要定位于细胞核。MoMerR蛋白包含MerR家族蛋白结构域特征,在MoMerR的77-120氨基酸残基间形成HTH(螺旋-转角-螺旋)(MerR超级家族成员特征),此外,53-96氨基酸残基间还具有RNA聚合酶sigma因子结构域特征。对其时空表达动态的分析发现,MoMERR在稻瘟菌的整个生长发育阶段以及侵染水稻阶段皆有表达,其中分生孢子梗10小时时期表达量最高,侵染初期表达量较高,表明该基因在分生孢子梗与分生孢子的形成、侵染初期发挥着重要作用。2.利用农杆菌介导的稻瘟菌遗传转化创制了同源重组的MoMERR基因缺失突变体(ΔMomer R),与野生型菌株比较发现ΔMomer R突变体的分生孢子形成能力下降,有性生殖能力反而增强;分生孢子的发育和致病能力受到显著影响,不仅附着孢产率下降,而且致病性受到抑制。有趣的是,虽然突变体和野生型在营养菌丝生长和形态上没有明显变化(包括在刚果红、山梨醇、盐和过氧化氢等胁迫条件下),但在高浓度锰离子条件下ΔMomer R表现出不敏感,菌落生长加快。对其生殖与侵染能力进行测定,发现与野生型相比,ΔMomer R的产孢量下降了近35%;孢子萌发产生芽管的速率没有显著变化;附着胞形成率下降了30%,附着胞在2M、4 M甘油的胁迫下表现出更高的塌陷率。ΔMomer R喷洒接种水稻叶片,形成与野生型孢子液喷洒叶片相比面积更小、数量更少的病斑;ΔMomer R孢子液点接水稻与大麦叶片也形成了面积比WT孢子液所形成更小的病斑。统计ΔMomer R与WT侵染水稻叶片病斑外侧菌丝扩展面积,病斑外距离是野生型的七分之一,这证明了基因缺失突变体致病能力的下降。在持续光照的条件下,基因缺失突变体与S1528交配形成的子囊壳数量比野生型与S1528形成的数量增加了二倍以上,并能更早形成子囊与子囊孢子。这些都说明MoMERR在稻瘟菌的繁殖与致病阶段都发挥着重要功能。3.MoMERR具有多种可变剪接模式。利用RT-PCR对各个生长发育时期的MoMERR基因进行了扩增,发现在各个生长发育时期,包括致病侵染时期MoMERR均存在着不同的剪接形式,目前共获得了18种剪接形式,奇怪的是,本研究没有发现不含有内含子片段的c DNA序列。MoMERR在菌丝的不同生长发育时期拥有不同的剪接方式,在菌丝两天时期存在1341bp,1253bp,1166bp,1071bp四种剪接方式;但个别剪接形式在不同时期仍会存在,如菌丝三天时期仍存在1341bp这种剪接方式,1071bp这种剪接presymptomatic infectors方式在菌丝2 d,3 d,5 d,分生孢子梗12 h以及附着胞时期都存在。附着胞形成时期剪接模式最为丰富,存在1260bp,1341bp,1188bp,1176bp,1167bp,1138bp,1071bp等七种形式。将测序结果与MoMERR基因序列进行比对,本研究发现剪接形式有着www.selleck.cn/products/iacs-010759-iacs-10759三种相似特点。第一种是在387-560bp中间进行的剪接,位点为CGCT-ACCA(红色部分为剪接掉的序列);第二种是747-869bp,973-1046bp,位点为GGAG-TAAG,TTGG-AAGC;第三种则是220-307bp,474-554bp,CTCT-ACTG,GTCC-CACC为剪接位点。为了进一步探究可变剪接方式的功能,把1260bp剪接形式(其在菌丝第六天与附着胞时期均可获得,属于第三种)连接在p KD7载体中进行ΔMomer R中的随机插入互补,发现多个互补突变菌株表型与ΔMomer R无明显差异。目前对MerR蛋白的研究普遍集中于原核生物,并且都与重金属胁迫、氧化胁迫与药物胁迫有关,MoMERR基因缺失突变体也表现出了对锰离子的敏感性变化,但未发现原核MerR家族成员生殖发育有关,而且原核生物基因表达不存在剪接机制。稻瘟菌MoMERR基因可变剪接模式与在生殖方式转变相关性,预示着MoMERR基因的进化关系和新型功能,为真核生物中MerR家族成员的功能研究赋予了新内容。另一方面,鉴于MoMERR在稻瘟菌的生长发育和致病中的作用,MoMERR也可以作为新的靶标,用于新型药物设计和筛选,因此本研究具有重要的科学价值和实践价值。