伪中间葡萄球菌是结膜囊内正常微生物系的优势菌落,当角膜抵抗力降低或受损时其会侵入角膜并导致角膜感染。亚硒酸钠对炎症、细胞生命周期和免疫环境调节等具有调控作用,呈现抗炎、抗氧化和免疫调节等功效,然而,目前并未有报道它会影响犬伪中间葡萄球菌性角膜炎。因此,通过将犬伪中间葡萄球菌接种于损伤的犬角膜建立伪中间葡萄球菌性Shared medical appointment角膜炎动物模型,然后用Na2SeO3溶液滴眼辅助治疗,探究亚硒酸钠对犬伪中间葡萄球菌性角膜炎的疗效影响;通过伪中间葡萄球菌感染体外培养的犬角膜上皮细胞(CCECs)建立体外感染模型,然后用不同浓度Na2SeO3处理细胞,检测CCECs炎性和氧化反应相关信号通路和细胞因子的变化,为亚硒酸钠应用于犬细菌性角膜炎治疗奠定理论基础。1.亚硒酸钠对犬伪中间葡萄球菌性角膜炎模型的辅助疗效观察试验分为5组,空白对照组为健康犬,不做处理;阴性对照组角膜被损伤,不接种伪中间葡萄球菌;造模组角膜被损伤后接种伪中间葡萄球菌,与阴性对照组均用乳酸钠林格液滴眼治疗;阳性对照组角膜损伤和染菌后用左氧氟沙星滴眼液滴眼治疗;加硒治疗组联合应用亚硒酸钠溶液与左氧氟沙星滴眼液滴眼;滴眼方法是每次每眼滴入2滴药液,每间隔2h滴眼一次,连续滴眼治疗48h。治疗期间检测眼泪液量和眼内压的变化,用裂隙灯和荧光素钠染色法观察角膜炎症和损伤的变化。于第48 h无菌采集角膜,部分用于角膜石蜡切片的制作,进行组织病理学观察;部分进行组织总RNA和总蛋白的提取,用于检测相关蛋白表达量与细胞因子mRNA表达。结果显示,接种细菌后各组的泪液量增多,眼内压下降,伪中间葡萄球菌致犬角膜基质层感染造成角膜浑浊、水肿并在损伤处形成溃疡灶,角膜表面有新生血管长入。加硒治疗组的病变程度轻于阳性对照组。模型组犬角膜组织中IκBα、p65磷酸化水平明显升高,且显著上调MyD88蛋白表达(p<0.05 或 p<0.01),IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MMP-2 以及 MMP-9 mRNA表达上调明显(p<0.05或p<0.01);角膜免疫组化染色显示NF-κBp65的表达升高(p<0.05)。用左氧氟沙星治疗和加硒治疗后,其IκBα、p65磷酸化水平明显降低,与此同时显著下调MyD88蛋白表达(p<0.05或p<0.01PLX4032溶解度),且加硒治疗组与阳性对照组相比,其IκBα磷酸化水平和MyD88蛋白表达量显著降低(p<0.01或p<0.05),说明亚硒酸钠可通过抑制角膜NF-κB信号通路减少炎性细胞因子表达,效果优于单纯用抗生素治疗。与造模组相比,阳性对照组和加硒治疗组角膜组织中Keap1蛋白表达水平显著降低(p<0.05或p<0.01)、Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表达水平显著升高(p<0.05和p<0.01),GCLC、GSTP1、GPX1 和 GPX4 的 mRNA 表达量显著升高(p<0.05和p<0.01),且与阳性对照组相比,加硒治疗组角膜组织中Keap1蛋白表达水平显著降低(p<0.05或p<0.01)、Nrf2、HO-1蛋白表达水平显著升高(p<0.05或p<0.01),GCLC、GSTP1、GPX1 和 GPX4 的 mRNA 表达量显著升高(p<0.05 或p<0.01)。说明亚硒酸钠治疗后角膜通过激活Nrf2/Keap1信号通路增加抗氧化因子的表达,进一步降低对角膜的损伤,改善角膜病变情况。2.亚硒酸钠对伪中间葡萄球菌诱导的犬角膜上皮细胞NF-κB通路表达的影响CCECs培养至80%融合时,对照组和S.pesudintermedius(S.p)组加入基础培养基,硒试验组分别加入终浓度为1、2或4 μmol/L Na2SeO3的基础培养基处理12h,随后S.p组和硒试验组按MOI=1:1加入对数生长期的S.p,培养后对细胞进行收集。对细胞炎性因子进行检测(主要用到了 qRT-PCR),用Western Blot检测NF-κB信号通路相关蛋白的表达情况。结果显示,与空白组相比,S.p组细胞IκBα、p65蛋白磷酸化水平升高(p<0.05或p<0.01),且极显著上调MyD88蛋白表达(p<0.01);IL-1β、IL-6和IL-8的基因相对表达量极显著增加(p<0.01),TNF-α基因相对表达量显著增加(p<0.05);亚硒酸钠以剂量依赖性的方式抑制了IκBα、p65蛋白磷酸化,与此同时也以同样的方式抑制MyD88蛋白表达(p<0.05或p<0.01),降低了 IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的基因表达水平(p<0.05)。3.亚硒酸钠对伪中间葡萄球菌诱导的犬角膜上皮细胞氧化应激的影响CCECs培养至80%融合时,对照组和S.p组加入基础培养基,硒试验组分别加入终浓度为1、2或4 μmol/LNa2SeO3的基础培养基处理12 h,随后S.p组和硒试验组按MOI=1:1加入对数生长期的S.p,继续培养不同时间后收集细胞,通过流式细胞术检测ROS表达水平,试剂盒法检测MDA含量、SOD与CAT的活力、T-AOC表达情况,用Western Blot检测细胞Nrf2/Keap1通路及相关蛋白的表达情况。结果显示,S.p侵袭后细胞内表达更高的ROS和MDA含量(p<0.01),且SOD、CAT活力极显著降低(p<0.01),T-AOC和GPX活性极显著降低(p<0.05或p<0.01);Nrf2、HO-1和NQO-1的蛋白表达量极显著降低(p<0.01),Keap1蛋白表达量显著升高(p<0.01)。与S.p组相比,1、2或4μmol/LNa2SeO3组呈剂量依赖性引起ROS和MDA含量降低(p<0.01),SOD、CAT活力显著或极显著升高(p<0.05或p<0.01),T-AOC和GPX活性显著升高(p<0.05或p<0.01);Nrf2、HO-1和NQO-1的蛋白表达量呈剂量依赖性显著升高(p<0.05或p<0.01),Keap1蛋白表达量呈剂量依赖性显著降低(p<0.01)。综上可见,犬角膜损伤感染S.pesudintermediusCB-839化学结构后泪液量增多,眼内压下降,水肿和损伤加重并形成溃疡灶,有血管向角膜损伤处增生。用左氧氟沙星滴眼液或抗菌药联合亚硒酸钠滴眼治疗均有效,但硒可改善单纯用抗菌药治疗的效果。并且亚硒酸钠能抑制S.pesudintermedius诱导的犬角膜和角膜上皮细胞NF-κB信号通路激活并减少炎性细胞因子基因表达,激活Nrf2/Keap1信号通路并增加抗氧化酶表达量或活性,减少氧化因子的含量,降低角膜和角膜上皮细胞的炎性反应和氧化损伤。