目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状为主要临床特征的慢性进行性中枢神经系统变性疾病。该病发病机制复杂,难以用单一学说完整阐述其病理变化,近年来,越来越多的证据表明神经炎性反应与AD的发病存在因果关系。但迄今为止,AD中炎性反应增加的原因尚不明确。小胶质细胞(Microglia,MG)是中枢神经系统的固有免疫细胞,目前广泛认为,小胶质细胞介导的炎性反应在AD发生及发展过程中发挥重要作用。小胶质细胞有两种状态,静息和激活;受环境的影响表现出多样性的表型,并可通过表型转化以维持组织稳态。小胶质细胞激活分为两种相反的表型:M1型小胶质细胞诱导炎症和促进神经毒性,而M2型小胶质细胞诱导抗炎和组织损伤修复。因此,如何调控小胶质细胞向M2表型转化已成为目前治疗AD的热点。自噬(Autophaselleck R428gy)是真核细胞中一种高度动态和严格调控的分解代谢过程,降解溶酶体中有缺陷的蛋白质或细胞器,维护细胞内稳态的平衡。越来越多的证据表明,自噬受损参与了AD的发病过程。目前认为,在AD早期增强的自噬是细胞对应激的保护性反应,但自噬最终会随着AD的进展而受损。mTOR是一种有效的自噬抑制剂,而AMPK不仅是组织中关键的能量传感器,也作为mTOR的有效抑制剂,AMPK抑制后mTOR的活性增强,抑制自噬发生从而损害细胞内稳态。ULK1介导自噬的起始,受AMPK-mTOR调控。我们推测AMPK-mTOR-ULK1通路参小胶质细胞自噬,调控小胶质细胞表型转化,影响炎性反应。白藜芦醇(Resvertrol,RES)是葡萄皮和葡萄籽中的一种天然多酚类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗癌和心脏保护多种生理和药理活性,并被发现在预防和治疗AD等退行性疾病中具有重要作用。白藜芦醇曾被报道以AMPK依赖的方式促进自噬,减轻AD动物模型病理改变,我们推测,白藜芦醇的抗AD作用可能是通过AMPK-mTOR-ULK1信号通路调控小胶质细胞自噬,促进小胶质细胞向M2表型转化。本实验拟从体内动物实验及体外细胞实验两方面入手,基于AMPK-mTOR-ULK1信号通路探讨小胶质细胞自噬对其表型转化的调控及白藜芦醇保护机制。方法:1.小胶质细胞自噬在AD炎性反应中的表达情况:(1)Aβ_(1-42)作用于BV2细胞构建AD细胞模型,MTT法及ELISA检测筛选Aβ_(1-42)最适造模浓度;将细胞分为Control组(空白对照组)及Aβ组(10μM Aβ_(1-42)干预组)。Western blot检测各组细胞自噬标志物Beclin1、LC3B的表达情况;免疫荧光双染观察各组细胞自噬标记物Beclin1及LC3B与IBA-1的共表达情况。(2)取野生型C57BL/6小鼠及6月、9月、12月龄APP/PS1转基因小鼠,分为WT组(野生型对照组)和AD模型组(APP/PS1 6M、APP/PS1 9M、APP/PS1 12M)。应用Western blot方法检测各组小鼠脑组织自噬标志物Beclin1及LC3B的表达变化;免疫荧光检测小鼠皮层Beclin1及LC3B与小胶质细胞标志物IBA-1共表达水平。2.小胶质细胞通过AMPK-mTOR-ULK1自噬通路调控表型转化:(1)将实验细胞分为3组:Control组(空白对照组)、Aβ组(10μM Aβ_(1-42)干预组)和Dorsomorphin组(10μMAMPK抑制剂Dorsomorphin干预组)。Western blot检测各组细胞中AMPK、mTOR、ULK1磷酸化蛋白及Beclin 1的表达;ELISA法检测各组细胞炎性因子IL-1β、IL-6、IL-18、IL-4的水平。(2)将实验动物分为4组:WT组(野生型对照组)和AD模型组:APP/PS1 6M、APP/PS1 9M、APP/PS1 12M。Western VE-822纯度blot检测各组动物脑内AMPK、小胶质细胞表型标志物i NOS(M1型)、Arg1(M2型)的表达水平;免疫荧光双染观察各组小鼠脑内i NOS、Arg1与AMPK共表达的情况;ELISA法检测各组小鼠脑组织分泌炎性因子的水平。3.白藜芦醇促进小胶质细胞自噬诱导M2表型转化的抗炎作用研究:(1)将实验细胞分为3组:Control组(空白对照组)、Aβ组(10μM Aβ_(1-42)干预组)和RES组(10μM白藜芦醇预处理1h)。MTT法检测白藜芦醇对细胞的活力影响;流式细胞学检测各组小胶质细胞的凋亡水平;Western blot检测各组细胞炎性小体NLRP3及pro-Caspase-1的表达水平,i NOS及Arg1的表达情况;ELISA法检测各组细胞IL-1β、IL-6、IL-18、IL-4的水平;免疫荧光染色观察i NOS、Arg1的表达情况;Western blot检测各组细胞AMPK、LC3B、Beclin1的表达水平;细胞透射电镜观察各组细胞结构及自噬小体。(2)选取野生型C57BL/6及9月龄APP/PS1小鼠,分为三组:WT组(野生型对照组饮双蒸水)、AD组(APP/PS1转基因小鼠饮双蒸水)、RES组(APP/PS1转基因小鼠饮双蒸水+白藜芦醇);喂养12周。采用Morris水迷宫对小鼠的学习和空间记忆能力进行评估,分别记录其逃脱潜伏期时长、目标象限停留时间以及平台穿越次数;免疫组化染色以明确各组小鼠皮层及海马Aβ沉积的情况;HE染色明确各组小鼠皮层及海马组织损伤情况;Western blot检测各组小鼠脑内Beclin1、p-AMPK、p-mTOR、p-ULK1,i NOS及Arg1的表达情况;免疫荧光双染观察各组小鼠脑内IBA-1、LC3B共表达情况;ELISA法检测各组小鼠脑组织IL-1β、IL-6、IL-18、IL-4的表达水平。结果:1.小胶质细胞自噬在AD炎性反应中的表达情况:(1)Western blot检测显示与Control组相比,Aβ组细胞自噬标记物Beclin1,LC3B的表达水平升高。免疫荧光双染示与Control组相比,Aβ组Beclin1、IBA-1,LC3B、IBA-1双染荧光强度均增强。(2)Western blot检测示与WT组相比,APP/PS1 9M、APP/PS1 12M小鼠Beclin1及LC3B表达升高,APP/PS1 6M小鼠较WT组无明显变化;APP/PS1 12M小鼠较APP/PS1 9M小鼠比较,Beclin1及LC3B表达下降。免疫荧光染色示较WT组相比,APP/PS1 9M、APP/PS1 12M小鼠皮层Beclin1及LC3B与IBA-1共表达水平升高;APP/PS1 6M小鼠Beclin1及LC3B与IBA-1共表达水平较WT组相比无明显变化。以上结果提示,自噬在AD细胞模型高表达,10μM Aβ_(1-42)为最适造模浓度,9月龄APP/PS1小鼠的自噬最明显适宜用作进一步实验研究。2.小胶质细胞通过AMPK-mTOR-ULK1自噬通路调控表型转化:(1)Western blot结果示与Control组相比,Aβ组p-AMPK、Beclin 1的表达增加,p-mTOR、p-ULK1的表达降低;Dorsomorphin组与Aβ组相比,p-AMPK、Beclin 1的表达降低,p-mTOR和p-ULK1的表达升高。ELISA法检测示与Control组相比,Aβ组IL-6、IL-18、IL-1β、IL-4水平上升;与Aβ组相比,Dorsomorphin组IL-6、IL-18、IL-1β水平上升,IL-4水平下降。(2)Western blot结果示与WT组相比,APP/PS1各组AMPK、i NOS、Arg1的表达均升高;APP/PS1 9M组AMPK、i NOS、Arg1的表达较APP/PS16M组增加;较APP/PS1 9M组相比,APP/PS1 12M组AMPK、Arg1的表达下降,i NOS的表达增加。免疫荧光双染示APP/PS1 9M组AMPK、i NOS,AMPK、Arg1双染荧光强度较WT组增强;APP/PS1 12M组较APP/PS1 9M组i NOS表达增强,Arg1表达减弱。ELISA法检测示与WT组相比,APP/PS1组促炎因子IL-6、IL-18、IL-1β水平随小鼠月龄增加逐渐增加,抗炎因子IL-4水平至9月龄最高。上述结果表明AMPK-mTOR-ULK1通路参与AD模型小胶质细胞自噬,并能够介导小胶质细胞向M2表型转化,调控炎性反应。3.白藜芦醇促进小胶质细胞自噬诱导M2表型转化的抗炎作用研究:(1)MTT细胞活性检测示在5-25μM浓度范围内,白藜芦醇对细胞活性无影响。流式细胞检测结果示与Control组相比,Aβ组细胞凋亡水平升高,RES组凋亡水平下调。Western blot结果示与Control组相比,Aβ组i NOS、Arg1、AMPK、LC3B、Beclin1、NLRP3、pro-Caspase-1的表达升高;与Aβ组相比,RES组i NOS、NLRP3、pro-Caspase-1表达下降,Arg1、AMPK、LC3B、Beclin1的表达升高。ELISA结果示与Control组相比,Aβ组IL-1β、IL-6、IL-18、IL-4水平上升;与Aβ组相比,RES组IL-1β、IL-6、IL-18的水平下降,IL-4的水平上升。免疫荧光染色示Aβ组i NOS、Arg1荧光强度与Control组相比增强,而RES组较Aβ组Arg1荧光强度增强,i NOS荧光强度减弱。细胞透射电镜示Control组部分细胞内可见少量自噬小体;Aβ组可见疑似凋亡细胞,细胞质内可见较多自噬小体;RES组细胞内可见大量自噬小体。(2)Morris水迷宫实验:隐蔽平台期的逃脱潜伏时间,RES组与AD组相比明显缩短;在空间探索实验的目标象限的滞留时间及穿越平台的次数,RES组均多于AD组。免疫组化染色及HE染色示白藜芦醇可降低12M APP/PS1小鼠皮层及海马Aβ沉积,改善脑组织损伤。Western blot检测示与WT组相比,AD组i NOS、Arg1、Beclin1、p-AMPK水平升高,p-mTOR、p-ULK1表达水平下降;RES组与AD组相比i NOS、p-mTOR、p-ULK1水平下调,Arg1、Beclin1、p-AMPK表达水平提高。免疫荧光双染示AD组IBA-1、LC3B双染荧光强度与WT组相比减弱,而RES组IBA-1、LC3B双染荧光强度较AD组增强。ELISA结果示与WT组相比,AD组IL-1β、IL-6、IL-18、IL-4水平上升;与AD组相比,RES组IL-1β、IL-6、IL-18水平下降,IL-4水平上升。结论:1.小胶质细胞自噬在AD细胞及动物模型中高表达,在9月龄APP/PS1小鼠脑内最明显。2.Anon-immunosensing methodsMPK-mTOR-ULK1通路参与AD模型小胶质细胞自噬,并影响小胶质细胞MI/M2表型转化。3.白藜芦醇可激活AMPK-mTOR-ULK1通路,诱导小胶质细胞自噬并向M2表型转化,发挥抗炎作用。