背景牙周炎是人类发病率最高的慢性感染性疾病之一,它通过激活宿主体内免疫,募集多种免疫细胞,导致牙周韧带、牙骨质和牙槽骨等牙周组织丧失和牙齿的丧失。为患者的生活带来极大不便,并且严重影响口腔健康。牙周炎的诱发因素有很多,例如患者不良的生活习惯如抽烟,例如全身性疾病的影响,例如基因遗传等。目前有关于全身性疾病对牙周炎的影响是近年来研究重点,全身性疾病如糖尿病、肝病、骨质疏松症、神经疾病带来的并发症会降低患者免疫力,增加细菌真菌等病原微生物侵染的风险,从而致使患者体内固有免疫被激活,加速促炎因子的分泌,导致骨组织被免疫细胞吞噬,减少骨量增加了骨吸收的风险。牙周炎也能增加系统性疾病发展的风险,例如患有牙周炎的患者会促进TNF-ɑ的分泌,影响下游胰岛器官,降低胰岛素的分泌,增加患者高血糖的风险,进一步损伤了患者免疫力致使宿主患有牙周炎。牙周炎是糖尿病的第六并发症。成功的牙周治疗对糖尿病患者的血糖控制有显著效果,这提示两者之间关联密切,可能存在相同的病理生理学机制。糖尿病相关的血清代谢产物、高血糖水平和晚期糖基化终产物(Advanced glycation end products,AGEs)是加重牙周炎症和口腔微生物组失调的主要因素。糖尿病性牙周炎(Diabetic periodentitis)病患众多,超过80%的二型糖尿病患者患有牙周炎,导致牙槽骨吸收和牙齿脱落,具有强危害性。于是对糖尿病性牙周炎的治疗就成了重要问题。预防牙齿脱落的主要解决办法就是增强骨再生能力,减少牙槽骨吸收。骨组织中有三种骨细胞,成骨细胞,破骨细胞和骨细胞。成骨细胞具有骨再生能力促进骨组织分化,破骨细胞具备骨吸收的能力,而骨细胞具备调节功能,它分泌细胞因子调节成骨细胞和破骨细胞的分化,调节骨再生与骨吸收,维持骨稳态。因此本课题决定把骨细胞作为治疗切入点,把骨细胞分泌因子的调控作为治疗依据,致使骨细胞更多的分泌抑癌蛋白DKK1抗体(recombinant dickkopf related protein 1,DKK1)等细胞因子促进成骨的分化,下调骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)等细胞因子降低破骨细胞的分化。许多抗生素和抗炎药都可以达到这样的功效。糖尿病性牙周炎的发病机制有很多,比如通过细胞铁死亡、焦亡、自噬等细胞死亡方式加重病理生理进程。其中铁死亡是一种与脂质过氧化物代谢相关的程序性细胞死亡方式,参与糖尿病、炎症等疾病过程。含有谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase 4,GPX4)和溶质载体家族7成员11(Solute carrier family 7,member 11,SLC7A11)的胱氨酸/谷氨酸转运体系统(cystine/glutamate transporter,Xc-)是铁死亡的经典通路,下调GPX4和SLC7A11的表达会触发铁死亡。发生铁死亡的细胞会出现线粒体损伤,氧化应激和脂质过氧化堆积等病理学现象。根据文献报道,骨关节炎和糖尿病中的成骨细胞会诱发铁死亡,但在糖尿病牙周炎领域却未见骨细胞铁死亡的报道。于是本课题把铁死亡作为治疗靶通路,把铁R428生产商死亡相关蛋白作为靶蛋白,探讨DP诱导的骨细胞是否激活铁死亡,能否从逆转骨细胞铁死亡这个视角治疗DP。白藜芦醇(Resveratrol,RSV)是一种具有强烈抗炎作用的天然化合物分子,已被证实可以治疗各类疾病。RSV可以下调白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-ɑ(Tumor necrosis factor-α,TNF-ɑ)抑制关节炎炎症的发生发展;RSV可以抑制过量乙醇诱导的房颤疾病中的铁死亡;RSV能够通过增加葡萄糖转运蛋白4向细胞膜转移,减轻自身免疫对胰岛B细胞的破坏,有效缓解糖尿病。但尚未见在糖尿病或牙周炎中关于铁死亡的相关报道。于是本课题采用RSV作为逆转铁死亡的化合物分子,探讨RSV是否可以作用骨细胞逆转骨细胞铁死亡。因此本课题从动物、细胞、分子层面,明确糖尿病性牙周炎发生的作用和机制,探讨RSV治疗糖尿病性牙周炎的可行性,在此基础上进一步探讨RSV对牙槽骨骨细胞铁死亡的抑制作用及机制。目的本课题将通过动物、细胞和分子层面,阐明铁死亡在糖尿病性牙周炎发生发展中作用和机制,并进一步观察RSV是否可以缓解糖尿病性牙周炎,探讨其调控糖尿病性牙周炎中牙槽骨骨细胞铁死亡的分子机制,为临床缓解糖尿病性牙周炎提供理论基础和新的治疗靶点及治疗策略。材料与方法第一部分:探讨铁死亡对糖尿病性牙周炎牙槽骨骨细胞功能的影响(1)建立体内体外糖尿病性牙周炎模型。利用高糖饮食和第二磨牙扎线法诱导DP小鼠模型,通过Micro-CT、IHC、HE染色、血糖测定等方法评价糖尿病性牙周炎建立是否成功。通过不同浓度的AGEs和LPS共培养24 h处理MLOY4(小鼠骨细胞)诱导DP细胞模型,通过RT-q PCR、ELISA和Capillary-based immunoassay评估炎症因子表达情况,筛选出合适的细胞炎症造模浓度。(2)糖尿病性牙周炎牙槽骨骨细胞中铁死亡机制探究。通过IHC和HE染色等方法检验小鼠牙槽骨骨组织评定是否体内激活DP诱导的牙槽骨骨细胞铁死亡,并探讨其诱发机制。通过RT-q PCR和Capillary-based immunoassay等方法检验骨细胞评定是否体外激活DP诱导的骨细胞铁死亡,并探讨其诱发机制。第二部分:探讨白藜芦醇对糖尿病性牙周炎诱导的牙槽骨骨细胞铁死亡的影响(1)RSV是否缓解糖尿病性牙周炎中骨细胞介导的炎症。通过IHC和HE染色等方法检验小鼠牙槽骨骨组织评定RSV体内缓解牙槽骨骨细胞炎症情况。通过RT-q PCR和CCK8等方法检验骨细胞评定RSV体外缓解骨细胞炎症情况。(2)RSV是否抑制糖尿病性牙周炎诱导的牙槽骨骨细胞铁死亡。通过IHC和HE染色等方法检验小鼠牙槽骨骨组织评定RSV是否体内抑制牙槽骨骨细胞铁死亡。通过RT-q PCR和Capillary-based immunoassay等方法检验骨细胞评定RSV是否体外抑制了骨细胞铁死亡。第三部分:白藜芦醇抑制糖尿病性牙周炎诱导的牙槽骨骨细胞铁死亡分子机制研究通过生信分析、TEM、MDA、Capillary-based immunoassay等方法检验小鼠牙槽骨骨细胞评定RSV是否通过下调NF-κB减弱了脂质过氧化堆积,从而抑制了骨细胞铁死亡。结果第一部分:探讨铁死亡对糖尿病性牙周炎牙槽骨骨细胞功能的影响(1)糖尿病性牙周炎小鼠诱导牙槽骨骨细胞铁死亡。DP小鼠较正常小鼠牙槽骨中GPX4和SLC7A11的表达显著下调,提示糖尿病性牙周炎体内激活牙槽骨骨细胞铁死亡。(2)糖尿病性牙周炎细胞诱导骨细胞铁死亡。DP组细胞较对照组细胞中GPX4和SLC7A11的表达显著下调,加入Fer-1后逆转该现象,提示糖尿病性牙周炎体外激活骨细胞铁死亡。第二部分:探讨白藜芦醇对糖尿病性牙周炎诱导的牙槽骨骨细胞铁死亡的影响(1)RSV体内抑制糖尿病性牙周炎诱导的牙槽骨骨细胞炎症和铁死亡。DP+RSV组较DP组小鼠组釉牙骨质界面-牙槽嵴顶距离(Cemento enamel junction-alveolar bone crest CEJ-ABC)显著下降,GPX4和SLC7A11的表达vaccine-associated autoimmune disease显著上升,提示RSV体内抑制糖尿病性牙周炎诱导的炎症和铁死亡。(2)RSV体外抑制糖尿病性牙周炎诱导的骨细胞炎症和铁死亡。AGEs+LPS+RSV组较疾病组骨细胞死亡数量减少;促炎因子表达显著下降;抑炎因子表达显著上升;GPX4和SLC7A11的表达显著上升。提示RSV体外抑制糖尿病性牙周炎诱导的炎症和铁死亡。第三部分:白藜芦醇抑制糖尿病性牙周炎诱导的牙槽骨骨细胞铁死亡分子机制研究RSV可能通过抑制NF-κB抑制脂质过氧化堆积,从而抑制糖尿病性牙周炎诱导的牙槽骨骨细胞铁死亡,缓解了糖尿病性牙周炎炎症。AGEs+LPS+RSV组较疾病组细胞脂质过氧化堆积显著下降;线粒体损伤数量减少;核转录因子蛋白家族(Nuclear factorκB)标志物蛋白表达下降。提示RSV通过下调NF-κB减弱脂质过氧化堆积,从而抑制了糖尿病性牙周炎诱导的牙槽骨骨细胞铁死亡,缓解了糖尿病性牙周炎。结论1、糖CP-456773溶解度尿病性牙周炎中激活牙槽骨骨细胞铁死亡。2、RSV减弱了糖尿病性牙周炎诱导的骨细胞炎症和铁死亡。3、RSV通过激活SLC7A11/GPX4,抑制了骨细胞铁死亡,缓解了糖尿病性牙周炎。4、RSV可能通过下调NF-κB信号通路,抑制了骨细胞铁死亡,缓解了糖尿病性牙周炎。