电针已在多种疾病的临床应用和科学研究中被证实拥有良好的镇痛效果,其对神经病理性疼痛和内脏疼痛的治疗效果尤为显著。研究发现,多种腺苷受体在电针缓解内脏超敏(Visceral Hypersensitivity,VH)中发挥重要作用,其中腺苷受体A1亚型(Adenosine Receptor A1,ADORA1)已被证实在外周组织中通过抑制IL-1β和P物质(SP)的表达缓解VH症状,但中枢ADORA1是否参与电针缓解VH仍不明确。反刍动物的电针镇痛效果优于其他物种,本试验在山羊上建立VH模型,研究电针缓解VH效果,了解其对山羊下行痛觉调制系统中ADORA1及其下游分子的影响,在此基础上采用化学法诱导小鼠内脏超敏,探究电针小鼠脊髓中ADORA1配体及其通路信号分子的变化,阐明电针通过ADORA1缓解VH的中枢机制。1.电针通过下行痛觉调制系统中的ADORA1-PLCB3信号通路缓解山羊内脏超敏为探究电针缓解VH的中枢机制,本试验通过回肠壁注射TNBS建立山羊的回肠炎性VH模型。自造模第7天开始,每3天通过电针刺激山羊“后三里”穴30 min,共7次。每次电针后,记录结直肠扩张(CRD)引起的山羊疼痛行为和内脏运动反应(VMR)变化。第7天和25天采集山羊回肠,通过宏观与微观病理变化以及炎性物质浓度变化评估其炎症状态。第25天采集山羊大脑中PAG、RVM和脊髓(SC)T11段组织,检测其中的c-Fos和CGRP的蛋白表达水平,评估山羊中枢敏化状态;检测腺苷(ADO)和磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)在PAG、RVM和SC中的含量变化;检测ADORA1、PLCB3和TRPV1在PAG、RVM和SC中的表达水平和ADORA1的分布情况。结果显示,在造模后第7天TNBS可以诱导山羊严重的回肠炎以及明显的VMR升高,并引起山羊中枢c-Fos和CGRP的表达水平升高,产生中枢敏化。在试验第25天检测发现,TNBS下调了山羊中枢ADORA1和PLCB3表达水平,但上调了TRPV1的表达。相比于TNBS组,电针显著抑制了由TNBS诱导的VMR升高,逆转了TNBS引起的c-Fos和CGRP上调,抑制了山羊中枢敏化;同时,电针增加了PAG、RVM和SC中ADO的浓度以及ADORA1和PLCB3的表达水平,下调了TRPV1的表达,并降低山羊中枢中PIP2的含量。以上结果表明,电针可能通过激活ADORA1-PLCB3信号通路减少中枢中PIP2从而抑制TRPV1激活缓解山羊内脏超敏。2.电针通过脊髓中ADORA1-PLCB3信号通路缓解小鼠内脏超敏关于ADO和ADORA1的近期研究结果表明它们在对各种疼痛的治疗中发挥积极作用。笔者已经在山羊中通过试验证明电针可能通过ADORA1-PLCB3信号通路缓解山羊VH,并在小鼠上成PF-02341066功建立了回肠炎性内脏超敏模型。但电针在小鼠中是否通过与山羊相同或相似的机制缓解小鼠VH仍不明确。因此在山羊试验结果的基础上,本研究以小鼠为模式动物继续探索电针缓解VH的中枢机制。本试验首先通过TNBS乙醇溶液回肠腔内注射建立小鼠VH模型:小鼠麻醉后,手术取出回肠和盲肠,在距回盲韧带处3 cm的回肠腔内注入100μL含5 mg TNBS的40%乙醇溶液,对照组注入等量生理盐水。分别在3、7和20天,评估小鼠疾病活动指数和痛阈变化情况,采集小鼠的回肠和脊髓T11段,观察回肠的宏观和微观病理变化;检测小鼠脊髓中c-Fos和CGRP的蛋白表达水平,评估小鼠的中枢敏化状态。结果显示,TNBS可以诱导小鼠严重的回肠炎症,在第3天病理变化显著;第7天仍显著高于对照组;至第20天时各种炎症检测指标之间的差异已经消失。小鼠的痛阈变化自造模开始后,期间虽有一定程度上升,全程均显著低于对照组,持续至第20天;TNBS造模小鼠脊髓中的c-Fos和CGRP的蛋白表达水平在第7和20天显著高于对照组,提示第20天小鼠仍处于中枢敏化状态。以上试验结果表明,100μL含5 mg TNBS的40%乙醇溶液回肠腔内注射可以引发小鼠回肠炎,并诱导小鼠产生持续至少20天的VH。对VH小鼠进行电针处理,通过检测发现,电针产生和其在山羊模型上相似的结果:即电针缓解了小鼠的VH并上调了ADORA1在小鼠脊髓中的表达。在以上试验基础上,鞘内注射ADORA1激动剂或拮抗剂后对VH小鼠进行电针处理,结果显示ADORA1的拮抗剂逆转了电针的镇痛作用,证明电针PF-03084014发挥镇痛作用需要ADORA1的参与。试验结果还显示,单次电针可以增加小鼠脊髓中ADO的含量,且小鼠的痛阈与脊髓中ADO含量存在正相关关系,电针在升高ADO浓度的同时减少了PIP2的含量。本研究在小鼠原代神经元上对ADO和ADORA1下游通路进行了进一步探究:ADORA1激活后,神经元中的PIP2含量显著下降,同时Ca~(2+)的浓度明显下降,这与单独激活PLCB3的结果一致;相反地,在先抑制PLCB3后再激活ADORA1,神经元中的PIP2和Ca~(2+)则一直保持较高浓度,说明ADORA1激活后通过PLCB3途径快速消耗神经元内的PIP2和Ca~(2+)发挥功能。以上结果表明电针通过升高小鼠脊髓中的ADO从而激活ADORA1-PLCB3途径发挥对小鼠VH的缓解作用。电针的治疗效Bioconversion method果具有累积作用,即多次电针的效果优于单次电针,因此本试验还探究了电针与ADORA1表达量及其与ADO含量的量效关系,结果显示:随着电针次数的增加(7次内),ADORA1表达量逐渐升高,而电针与ADO的含量变化则不存在这种量效关系;电针与小鼠脊髓中的TRPV1的表达量同样存在量效关系:随着电针次数的增多,TRPV1的表达量逐渐下降。以上结果共同证明:电针通过增加小鼠脊髓中ADO含量,激活ADORA1-PLCB3信号通路快速消耗神经元内PIP2和Ca~(2+)缓解小鼠内脏超敏,并通过上调ADORA1表达和下调TRPV1的表达实现多次电针对小鼠内脏超敏的累积缓解作用。