甲状腺癌是最普遍的内分泌系统恶性肿瘤,其发病率逐年上升,而且晚期甲状腺癌治疗效果差,复发率高。尤其是临床上出现的耐药性甲状腺癌,因手术治疗受限,亟待寻求能提高甲状腺癌疗效的新方法。放射治疗可以通过靶向传递电离辐射(Ionizing radiation,IR)的方式来根除癌细胞,是最有效的癌症治疗方法之一。但是,多数癌细胞会出现放射抵抗现象,联合其他治疗来提高癌细胞对放疗的敏感性将是急需解决的科学问题。铁死亡是一种非典型形式的细胞死亡方式,其具有脂质过氧化物大LGX818临床试验量堆积和细胞内谷胱甘肽所依赖的抗氧化机制失调的特征,与肿瘤的发生发展密切相关。谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase,GPX4)是一种抗氧化酶,能够水解细胞内累积的ROS,清除氧自由基,对铁死亡起负调控作用。理论上讲,在肿瘤细胞中下调GPX4的表达水平或酶活性,都能促进细胞发生铁死亡,因此,联合电离辐射和铁死亡途径可能有助于治疗包括甲状腺癌在内的放射抵抗性癌症。乙酰化是细胞内广泛存在的翻译后修饰(Post translational modification,PTM),作为表观遗传调控机制之一,参与细胞内的各种生物过程和信号通路。近年来,PTM在铁死亡中的作用备受关注,有研究发现,利用去乙酰化酶抑制剂可以上调GPX4的表达量并触发铁死亡进程,但是有关GPX4的乙酰化修饰如何影响铁死亡途径尚无报道。我们在预实验中发现,IR处理可致甲状腺癌细胞中GPX4的乙酰化水平升高。因此,在本论文中拟明确IR是否可以介导GPX4乙酰化诱导甲状腺癌细胞发生铁死亡,从而为甲状腺癌提供新的治疗策略。为此,本研究以TPC1、K1甲状腺癌细胞系以及HEK293T为细胞模型,先用IR照射和铁死亡调控剂处理细胞后,通过检测铁死亡相关指标来判断IR与铁死亡的相关性,然后通过检测GPX4的乙酰化水平对其蛋白稳定性的影响来判断IR是否通过介导GPX4的乙酰化诱导铁死亡,进而明确IR、铁死亡和GPX4乙酰化之间的相互作用关系及分子机制。本研究结果将为Isynthetic genetic circuitR联合铁死亡途径的相关关键因子为作用靶点的肿瘤靶向干预策略提供新的理论依据。本论文工作总结如下:第一,明确IR照射致甲状腺癌细胞死亡的方式:将不同剂量的IR与不同细胞死亡抑制剂联合使用,通过检测细胞存活力,确定了IR诱导甲状腺癌细胞发生以铁死亡为主并伴随一定程度细胞凋亡的细胞死亡;第二,利用生物学实验证实IR诱导铁死亡并下调GPX4蛋白水平:用不同剂量的IR单独处理与铁死亡调控剂联合使用,通过检测活性氧(Reactive oxygen species,ROS)/丙二醛(MaloMG132研究购买naldehyde,MDA)/谷胱甘肽(Glutathione,GSH)/CCK-8以及蛋白表达水平等,明确了IR可以诱导甲状腺癌细胞TPC1和K1发生铁死亡,抑制细胞增殖,并下调GPX4、XCT以及上调ACSL4蛋白的表达水平;第三,明确靶向GPX4的铁死亡诱导剂提高甲状腺癌细胞对放疗的敏感性:用Erastin或RSL3处理甲状腺癌细胞后,通过Western Blot以及CCK-8检测法确定了Erastin和RSL3对GPX4的靶向性;第四,确定GPX4是IR致细胞死亡的关键因素:在甲状腺癌细胞中过表达GPX4质粒,通过检测MDA、GSH、CCK-8以及蛋白表达水平,确定了GPX4是参与IR诱导甲状腺癌细胞死亡的关键因素;第五,明确IR和铁死亡诱导剂下调,GPX4乙酰化:在293T细胞中转染Flag-GPX4,通过Flag-IP以及Acetyl-IP实验,确定GPX4可被乙酰化修饰。随后,用IR和铁死亡诱导剂处理细胞后进行免疫沉淀结合Western Blot分析,发现IR和Erastin可以下调GPX4乙酰化水平;第六,明确GPX4 K148位点乙酰化与IR以及铁死亡途径相关:根据Phosph ositeplus网站预测GPX4的潜在乙酰化位点(K47R、K148R、K162R),并构建点突变质粒,验证质粒构建成功后,进行Acetyl-IP和Flag-IP,结果提示K148是GP X4主要的乙酰化修饰位点。综上所述,我们推测IR可以介导GPX4 K148位点乙酰化诱导甲状腺癌细胞发生铁死亡。本论文得到的实验结果将为铁死亡应用于癌症治疗中的靶点提供新思路。