干扰素(Interferon,IFN)在机体抗病毒过程中起着关键作用,OAS是干扰素在机体被病毒感染时诱导产生的抗病毒蛋白,猪OAS蛋白家族有OAS1、OAS2、OASL三个成员,OASLQ-VD-Oph小鼠作为潜在的干扰素刺激基因(Interferon-stimulated gene,ISG),为了方便后续对天然免疫的研究,本试验构建了猪OASL原核表达和真核表达载体,表达纯化了猪OASL蛋白,制备了单克隆抗体,并验证了猪OASL在Marc-145细胞上对PRRSV的抑制作用,具体如下:1.猪OASL蛋白原核表达及纯化试验通过把人工合成的猪OASL基因序列插入p ET-21a表达载体,构建p ET-21aOASL重组质粒,经优化最佳诱导条件,确定最佳诱导条件为37℃,220 r/min,8 h,异丙基-β-D-硫mediator subunit代半乳糖苷(IPTG)的终浓度为0.5 mmol/L,SDS-PAGE鉴定后为包涵体表达,经溶解、复性后使用亲和层析法(Ni柱)纯化猪Oselleck产品ASL蛋白。2.猪OASL单克隆抗体的制备选取6周龄的雌性BABL/c小鼠,将纯化后的猪OASL蛋白采用腹腔注射的方式,每只小鼠的免疫蛋白为50μg,免疫3次,每次间隔14天。三次免疫后采集血液,ELISA检测其抗体效价达到1﹕125000。加强免疫三天后,取脾脏进行细胞融合,筛选得到阳性克隆细胞,经过2次亚克隆后,筛选到一株杂交瘤细胞,命名为7D7E3。制备腹水的效价达到1﹕500 000,经Western blot鉴定,单抗可与猪OASL蛋白发生特异性反应,而不与P30蛋白反应。间接免疫荧光试验结果显示单克隆抗体与真核表达蛋白有良好的反应性。结果表明,试验成功筛选出了7D7E3单克隆细胞株,能够稳定分泌抗猪OASL抗体,且特异性较高。3.猪OSAL蛋白抗病毒效果的初探为了验证猪OASL蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在Marc-145细胞上的复制有无抑制作用。将猪OASL基因克隆至真核表达载体p CMV-3×Flag上,构建p CMV-3×Flag-OASL重组表达质粒,经Western blot检测到了猪OASL基因在Marc-145细胞中过表达,同时过表达猪OASL的细胞接毒48 h后通过检测PRRSV拷贝数的变化以及PRRSV病毒的滴度两个方面证实过表达猪OASL对PRRSV在Marc-145细胞上的复制有抑制作用。