猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是表现为腹泻、呕吐和脱水的猪肠道传染病,其特征为急性、高度接触性传播。猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea virus,PEDV)是导致PED的病原,目前广泛流行的GⅡ基因型PEDV毒株对新生仔猪的致死率接近100%,给我国养猪业造成了极大的经济损失。内质网应激是细胞处理非折叠蛋白的机制,在维持内质网稳态和决定细胞命运方面起着重要作用,研究表明内质网应激能抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒2、中东呼吸道综合征冠状病毒等人源冠状病毒的复制,而这些人源冠状病毒反过来又能干扰内质网应激相关蛋白的表达,但这种相互关系是否存在于PEDV和内质网应激之间还未被明确。本研究围绕PEDV和内质网应激之间的相互影响展开,旨在明确内质网应激对不同基因型PEDV复制的影响、解析PEDV拮抗宿主内质网应激的机制和开发相关抗PEDV分子,以期能为PEDV致病机制研究提供参考、为抗PEDV药物的开发提供新的靶点和新的抗病毒分子。具体研究内容如下:1.内质网应激抑制PEDV复制及其作用机制为明确内质网应激对PEDV复制的影响,使用经典的内质网应激诱导剂衣霉素(tunicamycin,TM)和毒胡萝卜素(thapsigargin,Tg)处理细胞。试验采取的药物处理方式是在病毒感染前使用TM、Tg预处理细胞8 h,以排除药物与PEDV病毒粒子或PEDV蛋白直接作用带来的影响。在Vero细胞上测试了内质网应激对GⅠ-b、GⅡ-a和GⅡ-b基因亚型PEDV复制的影响,结果显示PEDV的增殖水平随着TM、Tg浓度的增加而逐渐降低,在LLC-PK1细胞上的测试结果也显示TM、Tg预处理呈剂量依赖性抑制PEDV复制,另外还发现使用四苯基丁酸抑制内质网应激对PEDV复制有一定促进作用,表明内质网应激能协助宿主细胞抵御不同基因型PEDV的感染。本研究也在仔猪水平测试了内质网应激对PEDV复制的影响,给药方式为在攻毒前8 h给仔猪口服TM。结果显示TM处理组猪只肠道鼓气、肠壁变薄的现象明显少于病毒对照组,且TM处理组十二指肠、空肠、回肠和结肠的PEDV载量显著低于病毒对照组,表明内质网应激也能在动物水平有效抑制PEDV复制。进一步探究了协助内质网应激抑制PEDV的主要非折叠蛋白反应,结果显示只有激活蛋白激酶R样内质网激酶能抑制PEDV复制。另外还发现抑制肌醇需求酶1α对PEDV增殖有抑制作用,表明PEDV的复制可能依赖该途径。最后测定了内质网应激相关宿主蛋白对PEDV复制的影响,发现只有过表达78千道尔顿葡萄糖调节蛋白(78 k Da glucose-regulated protein,GRP78)会显著抑制PEDV复制,表明内质网应激标志蛋白GRP78是协助内质网应激抑制PEDV复制的主要宿主蛋白。2.PEDV抑制内质网应激标志蛋白GRP78表达及其作用机制为探究PEDV能否拮抗内质网应激的抗病毒效应,本试验评估了PEDV对GRP78表达的影响。定量PCR结果显示GⅠ基因型和GⅡ基因型PEDV都能促进GRP78转录,但Western Blot结果显示PEDV感染后GRP78蛋白的表达量并未增加,反而在病毒感染后36 h明显下降,因此推测PEDV可能在蛋白质水平负调节GRP78。在PEDV感染前后不同时间点使用TM、Tg处理细胞以进一步验证PEDV对GRP78蛋白表达的影响,结果显示在PEDV感染前8 h用TM预处理细胞或在PEDVCCRG 81045感染的同时用TM处理细胞,PEDV/TM组GRP78表达量都少于TM对照组,但降低幅度不大,推测和此两种条件下PEDV复制被显著抑制有关。进一步测试PEDV感染后24 h使用TM、Tg处理细胞对GRP78蛋白表达的影响,结果显示在此条件下GⅠ基因型和GⅡ基因型PEDV都能显著抑制TM、Tg诱导的GRP78表达,且该抑制作用在Vero细胞和LLC-PK1细胞中都能起效,表明PEDV能在蛋白质水平抑制GRP78表达。另外还发现PEDV能抑制质粒介导的GRP78过表达。鉴于PEDV促进GRP78转录,遂从m RNA翻译和蛋白质降解两方面探究PEDV抑制GRP78蛋白表达的机制,结果显示PEDV感染能降低细胞总的翻译水平,而干扰宿主蛋白质降解途径不能缓解PEDV对GRP78蛋白表达的抑制,表明PEDV主要通过抑制翻译实现对GRP78蛋白表达的负调控。3.PEDV nsp14抑制GRP78表达及其作用机制为进一步探究PEDV抑制GRP78表达的机制,本研究鉴定了协助PEDV抑制GRP78表达的主要病毒蛋白。测试了除非结构蛋白(non-structural protein,nsp)2、nsp3、nsp11以外所有PEDV蛋白对GRP78表达的影响,发现只有nsp14具有抑制GRP78表达的潜力。在HEK293t、Vero和LLC-PK1细胞上进一步明确了PEDV nsp14对GRP78蛋白表达的影响,结果显示nsp14能有效抑制TM、Tg诱导的GRP78表达,表明PEDV nsp14能在蛋白质水平负调节GRP78。为证实通过nsp14抑制GRP78表达是所有PEDV毒STM2457纯度株共有的特点,比较了83株PEDV的nsp14的氨基酸序列,发现PEDV nsp14存在24种氨基酸序列类型且这些序列类型的代表毒株涵盖了所有PEDV基因型。同源性分析结果显示这24种序列类型同源性平均值达99.25%,序列比对分析显示这些序列类型都不存在氨基酸的插入和缺失,且各功能位点都未突变,表明PEDV nsp14的氨基酸序列和功能十分保守。分别构建了核酸外切酶功能域和N7甲基转移酶功能域沉默的PEDV nsp14的表达载体,将这些载体转染到HEK293t细胞中以评估各nsp14突变体抑制GRP78蛋白表达的能力。结果显示只有点突变N7甲基转移酶功能域内功能位点完全沉默了PEDV nsp14抑制GRP78蛋白表达的能力,说明nsp14主要依赖N7甲基化转移酶功能域抑制GRP78蛋白表达。通过免疫沉淀结合液相色谱-质谱联用的方法解析与PEDV nsp14相互作用的宿主因子,共鉴定到153个特异蛋白,GO注释和信号通路聚类分析显示PEDV nsp14主要和翻译相关的宿主蛋白相互作用,表明PEDV nsp14能影响细胞翻译。通过嘌呤霉素标记试confirmed cases验证实PEDV nsp14能抑制细胞翻译,推测PEDV nsp14通过抑制翻译实现对GRP78蛋白表达的负调节。分析了PEDV nsp14的细胞定位,发现nsp14能进入细胞核,鉴于PEDV nsp14能抑制GRP78转录,推测nsp14可能在核内干扰GRP78转录的起始。进一步测试了PEDV nsp14对GRP78启动子的影响,发现PEDV nsp14通过干扰GRP78启动子活性抑制其转录。4.开发靶向内质网应激的抗PEDV分子鉴于内质网应激是一种有效的宿主抗PEDV机制,本研究以内质网应激为靶筛选抗PEDV分子,结果显示欧当归内酯A(Levistolide A,LA)具有抗PEDV活性。在Vero和LLC-PK1细胞上测试了LA对PEDV复制的影响,TCID_(50)、免疫荧光和定量PCR试验结果都显示LA呈剂量依赖性抑制GⅠ基因型和GⅡ基因型PEDV的复制,表明LA有被开发成抗PEDV药物的潜力。在PEDV感染后不同时间点用LA处理细胞,发现LA主要限制PEDV的吸附和入侵。进一步验证了LA抗PEDV和内质网应激的关系,发现LA能促进内质网应激相关基因ATF4、CHOP、GRP78的转录和GRP78蛋白的表达,而使用四苯基丁酸抑制内质网应激能拮抗LA对PEDV抑制作用,表明LA依赖内质网应激发挥抗PEDV作用。另外还发现通过NAC抑制内质网应激上游的氧化应激能拮抗LA对PEDV复制的抑制,表明LA的抗PEDV作用依赖氧化应激-内质网应激途径。