在自然界中,蛋白质是一切生命活动的基础,调节生命体的各项生理功能。参与蛋白质降解途径的泛素-蛋白酶体是很多学者关注的重点。其主要通过特异性降解细胞内大多数蛋白或转录因子的部分加工等,来调控高等真核生物细胞内几乎所有的生命活动,如细胞增殖、分化和DNA修复等。而其对细胞周期的调控作用是影响植物体器官生长的一个基本要素。烟草作为一种重要的经济作物,是我国烟草行业的主要原料来源,对其器官发育的研究具有重要的生物学意义和经济价值。有研究表明,DA1蛋白作为泛素激活肽酶的一种,在拟南芥等植物体的整个生长发育过程中发挥了重要作用,影响多种器官的大小和形态。而DA1基因在烟草中的功能研究尚不完善。Pidnarulex本研究以栽培烟草-红花大金元品种为研究对象,鉴定获得了两个与拟南芥AtDA1同源的基因,即NtDA1-1和NtDA1-2。进一步通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和过表达手段,对NtDA1基因进行转基因素材的创制。初步探究了烟草NtDA1基因对其腋芽、花冠和种子生长发育的影响。获得的主要结果如下:1.烟草NtDA1基因的鉴定、克隆及表达分析利用已报道的拟南芥AtDA1蛋白序列在烟草数据库中进行比对,鉴定到序列高度相似的两个同源基因,将其分别命名为NtDA1-1和NtDA1-2。克隆得到NtDA1-1和NtDA1-2基因的ORF框分别为1644 bp和1506 bp,编码548和502个氨基酸,分子量为62.08 k Da和56.88 k Da。二者CDS序列相似度为96.74%,氨基酸序列相似度为95.38%,暗示其功能可能高度相似。基因结构分析表明,二者都含有11个外显子和10个内含子。多序列比对表明,多个物种的DA1均含有典型的泛素受体互作基序UIM和单一锌指结合结构域LIM。系统进化树分析显示,烟草NtDA1-1和NtDA1-2与同为茄科植物的辣椒、马铃薯和番茄的亲缘关系较近,而与十字花科的甘蓝型油菜和拟南芥等植物的亲缘关系较远。组织表达谱特征分析表明,NtDA1-1与NtDA1-2在烟草的9个组织中均有表达,且在花冠、雄蕊和腋芽中较高量表达,其表达模式表现出高度相似性。亚细胞定位显示,烟草NtDA1-1定位于细胞质,NtDA1-2定位于细胞膜。2.烟草NtDA1基因敲除和过表达素材的创制为了探究烟草NtDA1基因的功能,我们创制了烟草NtDA1基因的敲除株系。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计了同时靶向NtDA1-1和NtDA1-2的3个sg RNA,经过农杆菌介导的遗传转化方法、T-克隆和Sanger测序等,获得NtDA1敲除转基因阳性植株。对其进行编辑形式检测,结果表明,sg RNA2能同时高效编辑NtDA1-1/2两个基因,编辑形式为碱基的删除、插入或替换,进而造成突变位点之后的密码子被替换或移码突变。通过对T1代植株进一步筛选,得到NtDA1基因的双敲(T1#20号)和单敲突变株(T1#33和46号),将其进一步培育,筛选获得了T2代NtDA1-1/2基因的纯合敲除植株。为了从另一方面探究烟草NtDA1基因的功能,我们创制了烟草NtDA1的过表达植株。通过酶切连接的方法构建了含有NtDA1-1和NtDA1-2的过表达载体,采用遗传转化的方法以及Sanger测序,获得了过表达阳性植株。q RT-PCR结果表明,相比野生型植株,T0#23、24和43号植株的NtDA1-1表达量明显升高,T0#6、14和20号植株的NtDA1-2表达量上调。由于遗传转化使得再生植株的形成时间更长,故我们在本阶段只获得了T2代的NtDA1基因双敲纯合突变体、单基因NtDA1-1、NtDA1-2的敲除纯合突变体和T0代的NtDA1-1和NtDA1-2的过表达植株,用于后续研究。3.烟草NtDA1基因的功能研究为了探究烟草NtDA1基因的功能,我们对野生型、NtDA1基因双敲植株和过表达植株进行selleck CH-223191了种植,观察其对烟草表型是否有影响。首先对腋芽进行了实验分析:为了研究烟草中NtDA1基因能否对分枝发育产生影响,对敲除植株进行打顶实验,结果显示,NtDA1基因的缺失并不影响打顶后腋芽的生长速度和长度,但会使腋芽的个数减少。说明腋芽的生长发育受多基因的调控,NtDA1基因只是该调控网络的一部分。对转基因植株的花冠进行观察分析发现,过表达植株花冠的花瓣缺刻(凹陷)较野生型变大,且花瓣的弧度变小,更圆润;而双基因敲除植株的花冠则较野生型更狭长,单基因敲除植株的花冠表型并不明显,说明在烟草中NtDA1基因参与了花冠最终形态和大小的形成。进一步的花冠石蜡切片实验显示,双基因敲除植株的叶肉薄壁组织和维管束细胞变大,而单基因敲除突变株无明显变化,过表达植株的叶肉薄壁组织更小,说明NtDA1基因参与了影响组成栅栏组织的薄壁细胞的大小。种子表型观察和重量统计实验表明,过表达植株的种子较野生型变小且重量显著减轻,而双敲突变体的种子变大,且敲除植株的种子重量显著加重,说明NtDA1基因影响了烟草种子的大小发育。参考拟南芥AtDA1基因突变体中,下游转录因子的表达情况,我们检测了烟草中NtDA1下游同源转录因子的表达量。结果表明,烟草中的NtDA1肽酶会抑制与细胞增殖相关转录因子的表Leech H medicinalis达,从而参与了烟草花冠和种子生长发育的调控。综上,本研究在烟草中鉴定并克隆到两个泛素激活肽酶NtDA1-1和NtDA1-2,并证明其在烟草花冠和种子的生长发育过程中发挥了重要作用。本研究对烟草器官发育方面的探究和DA1基因代谢途径的完善提供了有益的参考。