大口黑鲈因肉质鲜美、生长速度快、易于养殖等特点,目前已成为我国主要的养殖经济鱼类之一,且养殖规模呈逐年增长趋势。然而,种苗培育成活率低此网站已成为制约大口黑鲈规模化生产中的主要瓶颈。据目前的统计表明,其种苗培育成活率在全国不到20%,大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus,MSRV)是危害最为严重的病原之一,一旦暴发,将导致种苗大规模死亡,给产业造成巨大的经济损失。正是由于处于易感期的大口黑鲈种苗免疫系统未发育完善,疫苗免疫难以实现,因此,采取开口饲料药物防控是提高种苗成活率的重要手段。自利巴韦林等医用抗病毒药物被禁用以来,产业上尚缺乏专用抗病毒药物,MSRV防控更是无药可用,开展抗病毒药物的创新研究显得尤为重要。众所周知,天然产物是新药创新的出发点和药源库,从微生物中探索具有生物活性的天然产物是抗病药物或先导药物研发的重要途径之一。本研究通过分离大口黑鲈的肠道细菌,制备其培养上清和菌体沉淀的粗提物,并分析各粗提物的抗MSRV活性;进一步对具有活性的粗提物进行分离纯化和鉴定,明确其中抗病毒的活性成分,并从细胞水平和个体水平评价其抗病毒效果;在此基础上,并借助分子生物学和生物信息学手段探究该抗病毒活性成分潜在的作用靶点与机制。这些研究成果将为开发水产专用抗病毒药物和了解抗病靶点提供一定的理论依据。取得结果如下:1.抗大口黑鲈弹状病毒肠道微生物筛选采用平板划线法,从健康大口黑鲈肠道内壁分离和挑选形态差异明显的4株细菌进行抗病毒活性筛选;对各菌株进行发酵培养并通过离心分离获得各菌株的菌体沉淀和培养上清,随后通过甲醇萃取菌体沉淀和乙酸乙酯萃取培养上清制备了8种粗提物。通过CCK-8法初步检测各粗提物抗病毒潜力,结果显示分离菌MS01的菌体提取物(MS01-sed)在最大安全浓度下对感染MSRV的草鱼卵巢细胞(Grass carp ovary cell,GCO)的保护率最高,细胞存活率达90%。经形态学、分子生物学和生理生化鉴定,确定分离菌MS01为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。通过实时荧光定量PCR技术(Real time-quantitative polymerase chaBedside teaching – medical educationin reaction,RT-q PCR)检测、病毒滴度检测和细胞形态观察,发现30 mg/L和15 mg/L的MS01-sed均能够有效抑制MSRV基因在GCO细胞内表达,显著降低病毒滴度,抑制MSRV诱导的细胞病变。同时MS01-sed能够抑制MSRV诱导活性氧水平升高,提高SOD和CAT等抗氧化酶基因表达和酶活水平。此外,MS01-sed也能够显著降低鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus,SVCV)的滴度,有效抑制SVCV基因在斑马鱼胚胎成纤维细胞(zebrafish embryos fibroblast like cell,ZF4内表达。以上结果表明,MS01-sed具有潜在的抗MSRV活性,值得对其进一步研究。2.粘质沙雷氏菌MS01抗大口黑鲈弹状病毒活性代谢产物研究通过薄层色谱对MS01-sed初步分析,确定使用石油醚:乙酸乙酯为3:1的最佳配比作为展开剂(Rf值为0.53)进行分离。基于薄层色谱分析结果,利用硅胶柱层析法对MS01-sed进行大规模分离纯化,并获得两个分离产物(SED1和SED2)。在最大安全浓度下,SED1(0.13 mg/L)能够抑制MSRV诱导的细胞病变,抑制MSRV基因在GCO细胞内表达;而SED2(14.81 mg/L)对MSRV基因在GCO细胞内表达和MSRV诱导的CPE现象均无明显抑制作用,表明粘质沙雷氏菌代谢产物中抗MSRV的主要成分为SED1。使用紫外-可见光分光光度计扫描发现,溶于甲醇的SED1在537nm处具有最大吸收峰值。经高效液相色谱检测,在537 nm波长下SED1保留时间为18.29 min时出现单一色谱峰,峰面积比大于95%,提示其纯度达到95%。质谱结果显示SED1主要离子峰为324.2085 m/z,提示SED1主要是分子量为323.2的化合物,与粘质沙雷氏菌代谢产物灵菌红素(Prodigiosin,PG)相符。傅里叶红外光谱结果显示,SED1分别在3321.44、2943.39、2831.52、1660.72、1600～1400处以及1250～1000cm~(-1)范围内有吸收峰,与灵菌红素的官能团谱峰一致。综合检测结果并结合已经报道的文献,确定MS01-sed活性的分离物SED1为粘质沙雷氏菌代谢产物灵菌红素。3.灵菌红素抗大口黑鲈弹状病毒活性研究以GCO细胞为离体抗病毒试验材料,研究灵菌红素在细胞水平抗MSRV的效果。RT-q PCR检测结果表明灵菌红素对MSRV G蛋白、N蛋白和M蛋白基因表达的半数抑制浓度(Half MaxCL13900临床试验imal Inhibitory Concentration,IC_(50))分别为24.4 n M、27.9 n M和30.77 n M;通过检测病毒滴度,发现200 n M灵菌红素能显著降低MSRV在GCO细胞中的感染力;灵菌红素显著地减弱了MSRV引起的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),同时DAPI细胞核染色结果表明灵菌红素能够改善MSRV感染引起的细胞核损伤。此外,通过MSRV与灵菌红素体外孵育后感染、MSRV感染前灵菌红素处理、MSRV感染后灵菌红素处理3种方式处理细胞,结果表明灵菌红素对MSRV病毒粒子没有直接作用,但在感染前或感染后一定时间内用药,均能抑制MSRV在细胞中复制。随后以大口黑鲈为研究对象,研究灵菌红素在个体水平抗MSRV的效果。相比MSRV感染组,经过10 mg/kg灵菌红素处理的大口黑鲈体表病症减轻,存活率提高46.7%。灵菌红素在MSRV感染后的第2天和第4天显著降低大口黑鲈体内病毒滴度,在感染后的第3天显著降低大口黑鲈脑、肝脏、肾脏中的病毒拷贝数。由此可见,灵菌红素在细胞水平和个体水平均表现出良好的抗MSRV活性。4.灵菌红素抗大口黑鲈弹状病毒作用靶点预测与验证利用STITCH数据库分析灵菌红素互作关系网络,结果表明灵菌红素可能作用于细胞周期和p53信号通络。首先通过流式细胞术检测发现MSRV感染诱导GCO细胞的细胞周期阻滞在S期,并且S期阻滞有利于MSRV在细胞中复制。而灵菌红素处理可以调控细胞周期,抑制MSRV感染诱导的细胞周期S期阻滞。Western blot检测发现,细胞周期调控的关键调控因子p53蛋白在MSRV感染细胞的12 h和24 h受到抑制。灵菌红素处理激活细胞p53蛋白,而免受MSRV感染诱导的p53蛋白水平下调。使用p53蛋白抑制剂和激活剂处理发现,p53蛋白的激活在细胞抵抗MSRV感染过程中发挥了重要的作用。通过生物信息学分析,发现灵菌红素可以通过疏水作用、氢键结合等方式结合于p53蛋白的保守区域。通过原核重组技术构建大口黑鲈p53蛋白(ms-p53)原核表达质粒(p Cold-p53),经转化、诱导和纯化技术制备可溶性表达的ms-p53蛋白。利用圆二色光谱和等温量热滴定技术对灵菌红素与ms-p53蛋白互作进行验证,结果表明灵菌红素可以结合并与ms-p53蛋白形成稳定的复合物。综上所述,本研究通过从大口黑鲈肠道分离筛选得到一株粘质沙雷氏菌MS01,其菌体提取物具有抗MSRV活性,其中抗病毒活性成分经鉴定为灵菌红素;灵菌红素可以结合并稳定大口黑鲈p53蛋白,调节MSRV感染引起的p53下调和细胞周期S期阻滞,从而干扰MSRV在宿主细胞内的增殖。因此,本研究为开发抗MSRV的专用抗病毒药物提供了理论依据,同时为了解抗病靶点提供一定的理论指导。