水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一,全球范围内,超过半数的人口将水稻作为日常生活中的主食。在中国,水稻作为主食养活了全国60%以上的人口,提供约40%的总热量需求,是人类主要的热量和营养来源。随着世界范围内人们生活水平的提高和大米贸易的增加,人们对优质大米的需求越来越大,然而稻米品质改良的进展还远远落后于水稻产量的提高。目前,多种育种方式可对作物进行产量及品质改良,但传统育种方式较为耗费人工以及需要的时间年限较长。RNA引导的CRISPR/Cas核酸酶基因编辑技术作为全新的生物基因组编辑方法,可快速获得突变体材料。目前,利用CRISPR/Cas基因编辑技术已在多种生物体中引入有效突变,成为当前应用最广泛的基因编辑工具。本研究拟采用基因编辑的方式对水稻特定selleck产品蛋白合成相关基因进行编辑,通过这种方式快速获得目标基因发生突变的作物材料。本研究以稻米籽粒蛋白中占比最大的谷蛋白为出发点,构建靶向谷蛋白合成相关基因Glu A2、Glu B1、Glu C1与Glu D的敲除突变体。并对编码谷蛋白的基因进行多基因敲除,以期获得蛋白含量发生变化的稻米种质。同时,针对在稻米籽粒蛋白中占比仅次于谷蛋白的醇溶蛋白合成相关基因,构建分别靶向RPBF与RM1的敲除突变体,探索调控稻米蛋白质含量的新途径。研究结果如下:(1)从谷蛋白合成相关基因中选择4Student remediation个基因(Glu A2、Glu B1、Glu C1、Glu D),构建蛋白合成相关基因单突载体,在水稻栽培品种皖直粳006中对其进行单基因敲除。筛选获得阳性苗105株,编辑苗70株,纯合编辑植株11株。靶向Glu A2、Glu B1、Glu C1、Glu D的编辑效率分别为72.4%、51.4%、68.2%、88.2%。(2)对谷蛋白单基因敲除突变体植株进RAD001核磁行农艺性状调查结果表明,单独敲除谷蛋白合成相关基因时,不会对突变体植株的株高、穗长、穗粒数、结实率、千粒重等农艺性状造成明显影响。对突变体与野生型稻米蛋白的SDS-PAGE图谱进行灰度分析,相较于野生型,glub1与glud籽粒蛋白含量有所提高,glua2与gluc籽粒蛋白含量无显著变化。(3)构建谷蛋白合成相关基因多突载体,该载体可同时靶向Glu A2、Glu B1a、Glu B1b、Glu C1、Glu D基因。共获得84株阳性苗,其中74株发生基因编辑,经基因型鉴定共获得8种不同组合类型的多基因敲除突变体。突变体植株株高与野生型相比发生显著减低,2M、3M-2与3M-3穗长相较于野生型均有所变短,其它5种突变体穗长与野生型无显著差异。待收种后对其蛋白含量进行测定。(4)构建分别靶向醇溶蛋白合成相关基因RPBF与RM1的敲除突变体。单独敲除醇溶蛋白合成基因RM1时,突变体植株的穗长、穗粒数、结实率、千粒重等农艺性状无明显差异;在单独敲除RPBF基因时,突变体水稻植株的株高、穗长、穗粒数等农艺性状与野生型相比无显著差异。进一步分析发现,rpbf突变体植株结实率相较于野生型下降37.05%,千粒重更是下降68.5%(8.29 g VS 26.3 g)。(5)rpbf突变体籽粒蛋白SDS-PAGE图谱中各蛋白条带弥散状,说明蛋白亚基形成紊乱。BCA法测定籽粒蛋白含量,相同种子重量中,rpbf突变体种子醇溶蛋白的含量降低。但籽粒蛋白含量、谷蛋白含量高于野生型水稻。表明RPBF基因敲除后,对籽粒蛋白积累形式及蛋白含量产生较大影响。(6)进一步的,我们对突变体种子的氨基酸含量进行了测定。与野生型水稻相比,突变体rpbf水稻籽粒中共有12种氨基酸含量发生上调。敲除RPBF基因后籽粒中淀粉含量大幅降低,蔗糖含量显著升高,糊粉层的细胞层数和厚度都有不同程度增加。扫描电镜结果显示rpbf胚乳中淀粉颗粒呈球形不规则松散堆积。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas技术对谷蛋白合成相关基因进行敲除,快速获得稻米籽粒蛋白含量发生变化的稻米种质。此外,通过对醇溶蛋白合成相关基因RPBF的突变体分析,发现该基因除影响稻米醇溶性蛋白质含量外,还可调控稻米中淀粉与蔗糖的积累。此外,水稻作为单子叶模式植物,对其它单子叶植物籽粒蛋白相关研究具有参考价值,可为不同植物品质改良提供研究思路。