目的:探讨槲皮素激活核因子E2相关因子-2(Nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2)信号通路对大脑缺血再灌注损伤的作用及其机制,为减轻缺血再灌注损伤提供理论依据。方法:1.体外实验:(1)以无糖培养基与低氧工作站(5%CO_2,94.5%N_2,0.5%O_2)建立大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(高分化型)PC12细胞的糖氧剥夺/再灌注(Glucose and oxygen deprivation/reperfusion,OGD/R)模型,糖氧剥夺6小时,再灌注12小时,用梯度浓度的槲皮素干预。(2)CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测细胞活性,初步筛选槲皮素最佳剂量范围。(3)流式细胞术检测细胞凋亡率、细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,四甲基罗丹明乙酯(Tetramethylrhodamine,ethyl ester,TMRE)检测线粒体膜电位水平。(4)免疫荧光指示Nrf2在细胞中的位置,蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测总Nrf2与核Nrf2及其相关信号通路蛋白:Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch like epichlor-ohydrin related protein 1,Keap1)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate cysteine ligase catalytic subunit,GCLC)、NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1)、选择性自噬接头蛋白(sequestosome 1,P62/SQSTM1)的表达。(5)小干Galunisertib纯度扰RNA(Small Interfering Ribonucleic Acid,si RNA)沉默Nrf2的表达,实时荧光定量PCR(Real-Time q PCR,RT-q PCR)检测m RNA的表达。(6)检测Nrf2表达被抑制后相关通路蛋白的表达。检测细胞的凋亡率、细胞内ROS水平、超氧阴离子水平,验证Nrf2是否是槲皮素的作用靶点。2.体内实验:(1)在大鼠体内用线栓法建立大脑中动脉栓塞(Middle Cerebral Artery Obstruction,MCAO)模型:栓塞2小时后恢复血流供应,再灌注72小时;再灌注开始时给予不同剂量槲皮素(10 mg/kg·bw、25 mg/kg·bw、50 mg/kg·bw)腹腔注射。(2)2,3,5-氯化三苯基四氮唑溶液(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride solution,TTC)染色检测大鼠脑梗死体积,改良神经系统缺损程度评分(Modified Neurological Severity Score Points,m NSS)进行大鼠行为学评价。(3)用免疫荧光的TUNEL(d T-mediated d UTP Nick-End Labeling,TUNEL)染色检测大脑梗死侧神经元凋亡,苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色、尼氏(Nissl)染色检测大鼠脑皮层病理损伤情况。(4)透射电镜检测线粒体形态。(5)硫代巴比妥酸(Thibabituric Acid,TBA)法检测大鼠血清中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,羟胺法检测血清总超氧化物歧化酶(Total-Superoxide dismutas,T-SOD)含量。(6)免疫荧光指示Nrf2的分布与入核情况,Western Blot检测总Nrf2与其相关信号通路蛋白Keap1、HO-1、GCLC、NQO1的表达。结果:1.体外实验:(1)在常规培养条件下,与对照组(Ctrl)相比,槲皮素各剂量组的细胞活性无明显改变,差异无统计学意义;与Ctrl组相比,糖氧剥夺/再灌注(OGD/R)组的细胞活性显著下降,且差异有统计学意义(P<0.01);与OGD/R组相比,槲皮素1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L三个剂量组细胞活性均显著提高,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)与Ctrl组相比,OGD/R组细胞凋亡率显著上升,且差异有统计学意义(P<0.01);与OGD/R组相比,三组槲皮素干预组的细胞凋亡率均降低,其中5μmol/L剂量组的细胞凋亡率降低最明显,差异有统计学意义(P<0.01)。ROS实验结果显示,相较于Ctrl组,OGD/R组的细胞内ROS水平翻倍升高,且差异有统计学意义(P<0.01);与OGD/R组相比,三组槲皮素干预组ROS水平均降低,5μmol/L组ROS水平下降最明显,差异有统计学意义(P<0.01)。(3)与Ctrl组相比,OGD/R组的线粒体膜电位荧光强度下降,且有显著性差异(P<0.01);与OGD/R组相比,槲皮素干预组(OGD/R+Que)荧光强度增加,差异有统计学意义(P<0.01)。(4)与Ctrl组相比,OGD/R组细胞的Nrf2发生轻度核易位,OGD/R+Que组的细胞Nrf2发生明显核转位。核蛋白的Community paramedicineWB检测与之对应,与Ctrl组相比,OGD/R组细胞核内Nrf2轻度上升,OGD/R+Que组核内Nrf2明显上升,且差异有统计学意义(P<0.05)。(5)WB更多结果显示,Keap1的表达在三组细胞中无显著性差异(P>0.05);HO-1、NQO1、GCLC变化趋势与Nrf2一致:与Ctrl组相比,OGD/R组三种蛋白上升,但差异无统计学意义(P>0.05),OGD/R+Que组的上述蛋白表达进一步增加,其中HO-1、NQO1的增加明显,差异有统计学意义(P<0.01)。(6)与阴性对照组(NC)相比,针对Nrf2的si RNA(si Nrf2)显著抑制了Nrf2在细胞中的表达,且差异有统计学意义(P<0.01)。与OGD/R+Que组相比,槲皮素加Nrf2沉默(OGD/R+Que+si Nrf2)组的Nrf2、GCLC、HO-1、NQO1、P62均显著降低,且差异有统计学意义(P<0.01)。(7)与OGD/R+Que组相比,OGD/R+Que+si Nrf2组细胞的凋亡率显著升高,ROS水平与线粒体超氧超氧阴离子显著上升,且差异均有统计学意义(P<0.01)。2.体内实验:(1)假手术(Sham)组的大鼠无脑梗死,与Sham组相比,中动脉栓塞组(MCAO)大鼠脑梗死明显,且差异有统计学意义(P<0.01)。与MCAO组相比,三组槲皮素治疗组均减少脑梗死体积,其中50 mg/kg·bw组大鼠脑梗死体积下降最明显,差异有统计学意义(P<0.01)。(2)大鼠神经功能评分结果显示,Sham组大鼠分数均为0,与Sham组相比,MCAO组大鼠m NSS评分明显上升,差异有统计学意义(P<0.01)。与MCAO组相比,各槲皮素干预组m NSS评分均降低,其中50 mg/kg·bw组评分降低最明显,且差异有统计学意义(P<0.01)。(3)在透射电镜下,与Sham组相比,MCAO组大鼠神经元的线粒体明显肿胀、双层膜结构破坏严重、嵴断裂;槲皮素降低线粒体损伤,50mg/kg·bw剂量组改善作用最明显。(4)与Sham组相比,MCAO组大鼠血清MDA水平显著升高,T-SOD水平下降,且差异有统计学意义(P<0.01)。与MCAO组相比,50 mg/kg·bw槲皮素组的大鼠血清MDA水平显著降低(P<0.01),T-SOD水平显著上升,且差异有统计学意义(P<0.01)。(5)与Sham组相比,MCAO组大鼠的神经元TUNEL染色阳性率高,组织破坏严重;与MCAO组相比,槲皮素组(MCAO+Que)脑皮层神经细胞TUNEL阳性数减少,组织结构破坏减少。(6)WB结果显示,与Sham组相比,MCAO组大鼠的Keap1、HO-1无明显改变,差异无统计学意义,Nrf2、GCLC与NQO1显著降低,且差异有统计学意义(P<0.01);与MCAO组相比,MCAO+Que组的Keap1无明显改变(P>0.05),Nrf2及GCLC、NQO1蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:体外实验结果显示,槲皮素减缓OGD/R损伤导致的PC12细胞损伤,降低ROS水平,保护线粒体功能。体内实验结果显示,槲皮素减少MCAO导致的脑梗死体积,降低大鼠神经缺损水平;减少组织损伤与神经元凋亡,降低氧化应激水平。Nrf2是槲皮素作用的靶点,槲皮素通过调节Nrf2信号通路有效降低大脑缺血再灌注损伤。