核酸和蛋白质作为生命的遗传信息的载体,是生命科学研究的核心内容。荧光分析法作为一种先进的分析方法,广泛应用于生命科学研究等各个领域,如临床诊断、药物研发等。稳态荧光检测、单分子荧光检测是荧光分析蛋genetic interaction白质和核酸的重要方法。其中稳态荧光检测作为最常见的荧光分析方法,可以通过荧光光谱和荧光强度实现对生物分子的定性和定量分析。单分子荧光检测与传统的集成测量方法相比,具有灵敏度高、选择性好、分析时间快、样品消耗低的优点,可以被用作一种理想的分析方法来快速和简单地定量低丰度的生物分子。本论文中,我们结合稳态荧光光谱分析技术、单分子荧光检测技术(Single-molecule fluorescence detection,SMD)分别实现了对蛋白激酶和N~6-甲基腺嘌呤(N~6-methyladenosinEmpagliflozin生产商e,m~6A)的超灵敏检测。本论文主要包括以下内容:(1)蛋白激酶在细胞众多生理过程中扮演着重要角色,并可能作为包括癌症在内多种疾病的潜在诊断和治疗靶点。我们构建了一种选择性好、灵敏度高的自组装磁性荧光生物传感器,用于同时检测多种蛋白激酶。在蛋白激酶(即蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)和酪氨酸/苏氨酸蛋白激酶(RACα-serine/threonine protein kinase,Akt1))存在的情况下,它们对应的底物肽(即一个FITC标记的底物肽和一个Cy5标记的底物肽)被磷酸化,然后被生物素化的、可以特异性识别磷酸盐的双核金属配合物(phos-tag)特异性识别和捕获,生成生物素修饰的磷酸化的底物肽,用于磁珠-肽-FITC/Cy5结构的Docetaxel化学结构组装。磁分离后,在80℃的去离子水中将磷酸化的底物多肽从磁珠-肽-FITC/Cy5纳米结构中分离,释放出FITC和Cy5分子。通过稳态荧光检测测定释放的FITC和Cy5分子的荧光强度,FITC和Cy5的荧光信号分别与PKA和Akt1的活性成正相关。这种磁性生物传感器只涉及磷酸标签,不需要放射性标记、抗体筛选、羧肽酶Y(CPY)裂解和繁琐的化学/酶反应。磁珠的引入可以明显地去除复杂真实样品的干扰,提高信噪比。此外,该磁性生物传感器可以准确测量细胞蛋白激酶活性并筛选抑制剂,在激酶相关的生物医学研究和治疗应用中具有巨大潜力。(2)m~6A是真核生物m RNA中最常见的化学修饰,参与多种生理过程,包括癌症的发生和病毒感染。m~6A检测技术的发展对研究m~6A的生物学功能具有重要意义。在此,我们开发了一种基于无铜、无酶的点击化学介导的连接检测反应(ligation detection reaction,LDR)循环扩增的单量子点(Quantum dot,QD)纳米传感器,用于检测m~6A。我们设计了四个DNA探针,即叠氮化物(N_3)标记的探针a,二苯并环辛(DBCO)修饰的探针b、带有生物素和N_3标记的探针c、DBCO和Cy5标记的探针d。在毒素蛋白内切酶(m RNA Interferase-Maz F,Maz F)的作用下,无m~6A修饰的RNA序列被Maz F切割,而有m~6A修饰的RNA序列保持完整。m~6A-RNA与探针a和探针b相互杂交形成三明治结构,形成的三明治结构导致DBCO和N_3基团相互靠近,发生点击化学反应形成三唑结构,随后形成探针a-b连接产物。然后通过变性反应,释放的m~6A-RNA可以作为模板与更多的探针a和探针b杂交,通过95℃和25℃的热循环启动第一个LDR。随后,产生的探针a-b连接产物作为模板与探针c和探针d进行杂交,探针c和探针d中的N_3和DBCO基团在无铜点击化学反应后可以形成三唑结构。在95℃的变性过程中,释放的探针a-b的连接产物与更多的探针c和探针d杂交,通过95℃和25℃的热循环启动第二个LDR扩增,产生丰富的探针c-d的连接产物,其5’端为生物素修饰,3’端附近带有Cy5修饰。由此产生的c-d的连接产物与QD结合,产生FRET信号。这种检测方法既不涉及逆转录,也不涉及铜催化剂或连接酶,而且表现出高选择性和高灵敏度(检测限为1.42×10~(-15) M)。此外,该纳米传感器可以分辨出m~6A-RNA和A-RNA混合物中0.01%的m~6A-RNA,并且可以准确地定量癌细胞中的m~6A。