选题依据:抑郁症是一种常见的精神疾病,全球有近3.5亿患者受其困扰。在对抑郁症患者进行分析时发现,女性患者占比为68%,远高于男性。然而目前女性较男性更易患抑郁症最主要的假设则是女性同男性生理及生殖结构的差异,因此推测这一现象可能与女性体内雌激素水平频繁波动有关。柴归颗粒是课题组前期研发的一种新的抗抑郁中药,已被证明具有确切的抗抑郁效果。课题组在前期研究中发现雄性慢性不可预知性温和应激(Chronic Unpredictable Mild Stress,CUMS)大鼠体内睾酮(Testosterone,T)与雌二醇(Estradiol,E2)水平显著降低,经过柴归颗粒治疗后可以显著升高雄性CUMS大鼠体内T与E2水平,进而激活雌激素下游相关信号通路发挥抗抑郁疗效。然而柴归颗粒对雌性CUMS大鼠的抗抑郁效果如何,柴归颗粒如何影响与调节雌性CUMS大鼠体内E2水平,雌性和雄性CUMS大鼠行为学与性激素之间的变化有哪些不同,引起这些不同的内在因素又可能是什么,这些问题尚不明确。因此,本研究首先通过建立雌性CUMS大鼠抑郁模型,验证柴归颗粒对雌性CUMS大鼠的抗抑郁疗效,其次,对雌性CUMS大鼠体内E2生成与分解途径进行分析,明确柴归颗粒对雌性CUMS大鼠体内E2的可能调控机制,为柴归颗粒的临床合理应Lapatinib作用用提供新的理论支撑。最终,通过将本研究的实验数据同课题组前期雄性CUMS大鼠实验数据进行对比分析,明确雌性与雄性CUMS大鼠在行为学表观上的差异,并对下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)与性激素相关指标进行综合分析,初步探索引起雌性与雄性大鼠行为学表现差异的可能原因,为柴归颗粒调控雌性和雄性CUMS大鼠体内不同途径来发挥抗抑郁疗效提供了参考依据,也为临床上应用中药防治抑郁症提供新的思路。目的:1.明确柴归颗粒对雌性CUMS大鼠的抗抑郁效果。2.从E2的生成与分解两条途径分析柴归颗粒对雌性CUMS大鼠血清与海马内E2水平的调节机制。3.基于雌性与雄性CUMS大鼠行为学表观差异,探究柴归颗粒治疗雌性与雄性CUMS大鼠的可能机制。方法:1.在前期剂量筛选实验的基础上增加了2个柴归颗粒剂量组(共5个),通过建立雌性CUMS大鼠模型,观察柴归颗粒对雌性CUMS大鼠行为学和HPA轴的调节效果,明确柴归颗粒对雌性CUMS大鼠的抗抑郁药效。采用主成分分析对大鼠行为学指标赋值,整合分析后更清楚且直观地反映出柴归颗粒不同给药组大鼠的恢复效果。2.采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定大鼠血清和海马内T、雌酮(estrone,E1)、E2、二羟基雌二醇(2-hydroxy-17β-estradio,2-OH-E2)和四羟基雌二醇(4-hydroxy-17β-estradiol,4-OH-E2)水平,分析柴归颗粒对雌性CUMS大鼠血清与海马内E2相关性激素水平的影响。3.采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-q PCR)技术和蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)技术测定雌性CUMS大鼠海马内E2合成途径中关键调节酶(CYP19A1、HSD17B1)和E2分解途径中关键调节酶(CYP1A1、CYP1B1)m RNA和蛋白水平表达,从分子水平验证柴归颗粒对雌性CUMS大鼠海马内E2合成与分解的调节作用。4.首先将雌性与雄性CUMS大鼠行为学、HPA轴和性激素水平进行比较分析,初步了解雌性和雄性CUMS大鼠在行为学、HPA轴和性激素水平方面的表现差异。采用主成分分析和Pearson相关性分析的方法,分别解析雌性和雄性CUMS大鼠的情志指数与HPA轴综合指数和性激素综合指数的相关性,进一步阐明导致雌性和雄性CUMS大鼠外在行为表现差异的内在原因。结果:1.行为学指标与HPA轴相关激素水平结果:(1)行为学指标:与空白组相比,CUMS造模导致雌性大鼠旷场穿越格数、旷场直立次数、糖水偏爱率、体重显著降低(P<0.05,P<0.01),强迫游泳不动时间显著增加(P<0.01)。与模型组相比,柴归颗粒5个剂量组中大鼠旷场穿越格数、旷场直立次数显著升高(P<0.05,P<0.01),柴归颗粒B剂量组在大鼠旷场穿越格数实验中效果最好,柴归颗粒B和C组在旷场直立次数实验中效果最好。柴归颗粒A、B、C、D剂量组大鼠糖水偏爱率和体重显著升高(P<0.05,P<0.01),柴归颗粒B剂量组在糖水偏爱实验中改善效果最佳,柴归颗粒A、B、C剂量组则对大鼠体重的改善效果最好。柴归颗粒5个剂量组中大鼠强迫游泳不动时间显著降低(P<0.05);与空白组相比,模型组大鼠探索新物体时间、在明箱所占时间A、B、进入开臂的时间比、开臂探头次数、穿越平台次数和到达平台所用时间均显著降低(P<0.05,P<0.01)。与模型组相比,柴归颗粒5个剂量组大鼠探索新物体时间、开臂探头次数和到达平台所用时间均显著升高(P<0.05,P<0.01),其中柴归颗粒A、B组大鼠在探索新物体时间实验中改善效果最好,柴归颗粒B剂量组在开臂探头次数实验中效果最好。柴归颗粒A、B剂量组大鼠在明箱所占时间显著升高(P<0.05)。柴归颗粒A、B、C剂量组大鼠进入开臂的时间比显著升高(P<0.05,P<0.01),其中柴归颗粒B和C剂量组效果最佳。柴归颗粒A、B、E剂量组穿越平台次数显著升高(P<0.05)。(2)HPA轴相关激素水平:与空白组相比,模型组大鼠血清中促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)、促肾上腺皮质激素(adreno-cortico-tropic-hormone,ACTH)和皮质酮(corticostatin,CORT)水平显著升高(P<0.05,P<0.01)。与模型组相比,柴归颗粒A、B和C剂量组大鼠血清中CRH水平显著降低(P<0.05)。柴归颗粒A、C和D组大鼠血清中ACTH水平显著降低(P<0.05)。柴归颗粒A、B、C和D组大鼠血清中CORT水平显著降低(P<0.05,P<0.01),其中柴归颗粒A和D组改善效果最佳。表明柴归颗粒对雌性CUMS大鼠同样具有显著的抗抑郁效果。通过对行为学指标进行赋值分析,发现柴归颗粒各剂量组中雌性CUMS大鼠的抑郁样行为均显著改善。通过对不同行为学数据进行整合分析,发现柴归颗粒B剂量组对雌性CUMS大鼠的抑郁样行为改善效果最佳。2.血清和海马内E2相关性激素水平测定结果:(1)E2的调节效果:与空白组相比,模型组大鼠血清和海马内E2水平显著降低(P<0.05)。与模型组相比,柴归颗粒A、B、C和D组大鼠血清与海马内E2水平显著升高(P<0.05,P<0.01);(2)T和E1的调节效果:与空白组相比,模型组大鼠血清和海马内T与E1水平显著降低(P<0.05,P<0.01)。与模型组相比,柴归颗粒A、B和C组大鼠血清内T水平显著升高(P<0.05),柴归颗粒A和B剂量组海马内T水平显著升高(P<0.01);柴归颗粒5个剂量组大鼠血清与海马内E1水平均显著升高(P<0.05,P<0.01)。(3)2-OH-E2和4-OH-E2的调节效果:与空白组相比,模型组大鼠血清和海马内2-OH-E2水平显著降低(P<0.05),4-OH-E2水平有下降趋势,无显著性差异。与模型组相比,柴归颗粒B和D组大鼠血清内2-OH-E2水平显著升高(P<0.05),柴归颗粒A、B、C和D组大鼠海马内2-OH-E2水平显著升高(P<0.05)。表明柴归颗粒不仅可以通过提高雌性CUMS大鼠血清与海马内T与E1水平来促进E2的合canine infectious disease成,而且还能够提高雌性CUMS大鼠血清和海马内2-OH-E2水平达到促进E2分解的selleckchem Berzosertib效果,从而使柴归颗粒剂量组大鼠血清与海马内E2水平维持在正常稳态范围。3.RT-qPCR与WB实验结果:(1)E2合成途径:与空白组相比,模型组大鼠海马内促进T向E2转化的关键酶(CYP19A1)与促进E1向E2转化的关键酶(HSD17B1)的m RNA和蛋白表达显著降低(P<0.01)。与模型组相比,柴归颗粒B、C和D组大鼠海马内CYP19A1的m RNA表达显著升高(P<0.05,P<0.01),柴归颗粒B和C组大鼠海马内CYP19A1蛋白表达显著升高(P<0.05,P<0.01)。柴归颗粒5个剂量组大鼠海马内HSD17B1的m RNA表达均显著升高(P<0.05,P<0.01),而柴归颗粒B和C组大鼠海马内HSD17B1蛋白表达显著升高(P<0.05);(2)E2分解途径:与空白组相比,模型组大鼠海马内促进E2向2-OH-E2转化的关键酶(CYP1A1)与促进E2向4-OH-E2转化的关键酶(CYP1B1)的m RNA和蛋白表达显著降低(P<0.01)。与模型组相比,柴归颗粒A和B组大鼠海马内CYP1A1的m RNA表达显著升高(P<0.01),柴归颗粒5个剂量组大鼠海马内CYP1A1蛋白表达均显著升高(P<0.05,P<0.01)。柴归颗粒5个剂量组大鼠海马内CYP1B1的m RNA表达均显著升高(P<0.05,P<0.01),而柴归颗粒B、C、D和E组大鼠海马内CYP1B1蛋白表达显著升高(P<0.01)。4.雌性与雄性CUMS大鼠行为学、HPA轴和性激素水平的比较与相关性分析实验结果:(1)雌性与雄性CUMS大鼠的比较分析:与雄性大鼠相比,CUMS应激使雌性大鼠表现出更明显的抑郁样行为,如快感缺乏、静止和探索行为。这与雌性和雄性CUMS大鼠体内HPA轴和性激素水平变化差异有关;(2)雌性与雄性CUMS大鼠的相关性分析:结果表明不论雌性还是雄性大鼠,行为学指标均与其HPA轴和性激素指标存在显著的相关性,而雌性大鼠行为学指标与其HPA轴和性激素指标间的相关性高于雄性大鼠,提示雌性大鼠可能比雄性大鼠更易受到HPA轴与性激素水平波动变化的影响。结论:柴归颗粒可不同程度地改善雌性CUMS大鼠的抑郁样行为,同时对其HPA轴相关激素都具有显著的调节作用,其中以柴归颗粒B剂量组效果最佳。通过分析雌性CUMS大鼠海马内E2合成与分解两种途径,发现柴归颗粒不仅可以通过促进E2合成途径的关键酶CYP19A1和HSD17B1的m RNA和蛋白质的表达,增加T向E2转化以及E1向E2的转化。还可促进E2分解途径的关键酶CYP1A1和CYP1B1的m RNA和蛋白质的表达,增加E2向2-OH-E2和4-OH-E2的分解,从而使雌性CUMS大鼠海马内E2水平恢复至正常稳态范围内。在进行雌性与雄性CUMS大鼠的差异分析时发现,CUMS应激在雌性大鼠中诱导了相对更早、更明显的抑郁样行为,这可能与雌性大鼠较雄性大鼠相比更容易受到HPA轴与性激素水平波动影响有关。