日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)属于黄病毒科黄病毒属,是一种蚊媒性的人畜共患病病原。JEV主要靶向中枢神经系统,可诱导剧烈的神经炎症反应,导致神经损伤。但目前为止JEV引起神经元损伤的具体机制仍不清楚。铁死亡是一种新发现的、以铁依赖性的过氧化物集聚为特征的程序性细胞死亡。已有大量研究显示,铁死亡在许多疾病的发生与病原微生物的致病过程中起到关键作用,但其在JEV致病过程中的作用仍缺乏相关报道。因此,本课题以JEV为研究对象,探究JEV能否诱导神经元发生铁死亡,在此基础上进一步揭示其分子机制,明确铁死亡在JEV致病中的作用,为阐明JEV的致病机制和治疗药物的开发提供新的科学线索。主要研究内容如下:1.JEV感染诱导神经元铁死亡本研究发现JEV感染人神adolescent medication nonadherence经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y和原代小鼠神经元后,铁死亡标志性基因PTGS2的m RNA水平明显上调,并且JEV感染能引起这两种细胞发生脂质过氧化,而铁死亡抑制剂能抑制JEV感染引起的神经元死亡和脂质过氧化。除此以外,JEV感染小鼠脑组织中PTGS2 m RNA和脂质过氧化水平也明显上调。这些结果表明JEV感染能诱导神经元细胞发生铁死亡。为了研究这一现象是否为细胞种类特异性,我们检测了JEV感染其他易感细胞系(He La、BHK-21和BV2细胞)后铁死亡的现象,结果发现,JEV感染BHK-21细胞后可引起铁死亡,而感染He La细胞和BV2细胞则没有此现象,说明JEV引起的铁死亡具有细胞选择性。2.JEV通过抑制GSH-GPX4通路诱导神经元铁死亡为了探究JEV感染引起神经元铁死亡的分子机制,我们检测了铁死亡的重要负调控分子谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的相关信号通路,发现JEV感染抑制SHSY5Y细胞中GPX4的表达,并且使GSH的含量显著下调,证明JEV可能通过降低神经元细胞内GSH的水平抑制GPX4的表达。为了进一步确定GPX4在JEV诱导的铁死亡中的作用,我们构建了GPX4过表达的SH-SY5Y细胞系,发现GPX4过表达后,JEV诱导的铁死亡现象明显被抑制。上述结果证明,JEV可通过抑制GSHGPX4信号轴,破坏神经元细胞内的抗氧化系统,进而导致铁死亡的发生。3.JEV通过促进ACSL4介导的脂质过氧化诱导神经元铁死亡除了GSH-GPX4信号通路以外,长链酯酰辅酶A合成酶4(ACSL4)也是调控铁死亡的重要信号分子。本研究发现,JEV感染促进了SH-SY5Y细胞中ACSL4及其上游YAP1的表达。为了进一步研究YAP1-ACSL4信号通路在JEV诱导铁死亡中的作用,我们将JEV感染YAP1和ACSL4敲除的SH-SY5Y细胞,结果发现,YAP1和ACSL4敲除可抑制JEV感染引起的脂质过氧化。以上结果表明JEV感染可能通过促进YAP1以及AC确认细节SL4的表达,引起神经元细胞内多不饱和脂肪酸合成紊乱,从而促进脂质过氧化并导致铁死亡的发生。4.JEV prM和E蛋白参与诱导神经元铁死亡发生为了探究JEV诱导神经元铁死亡的主要成分,将JEV经紫外线照射灭活后接种SH-SY5Y细胞,发现灭活后的病毒仍可诱导细胞铁死亡,说明可能是其结构蛋白发挥作用。进一步将表达各结构蛋白的慢病毒转导SH-SY5Y细胞,发现pr M和E蛋白的表达可诱导铁死亡的发生,而C蛋白没有此作用,证明JEV的pr M和E蛋白是诱导神经元铁死亡的关键蛋白。5.铁死亡参与调控JEV诱导的神经炎症反应和致病为了探究铁死亡是否与JEV的复制和诱导的神经炎症反应有关,本研究使用铁死亡抑制剂Liproxstatin-1处理SH-SY5Y和原代小鼠神经元并感染JEV,结果发现,铁死亡抑制剂可抑制JEV在SH-SY5Y中的复制,并抑制JEV感染原代神经元和胶质细胞中炎症因子的表达。为了进一步研究铁死亡在JEV致病中的作用,本研究将铁死亡抑制剂注射JEV感染的小鼠,结果证明,注射Liproxstatin-1后可显著提高JEV感染小鼠的存活率,并缓解JEV感染引起的临床症状和脑组织炎症反应。上述结果表明,铁死亡可促进JEV诱导的神经炎症反应,并在其致病中发挥关键作用。综上所述,本研究证明了JEV感染能诱导神经元铁死亡,初步解析了JEV诱导铁死亡的分子机制,揭示了铁死亡在JEVBarasertib致病中的作用,为阐明JEV致病机制和治疗药物的研发提供了重要科学线索和分子靶标。