目的:核酸药物是继传统小分子药物和抗体药物后的第三次制药行业浪潮热点,截至2022年12月,共有17款核酸药物被FDA批准上市。核酸药物能够从源头进行干预,通过抑制或上调疾病相关基因表达,或提供编码靶抗原或免疫原的转录本,达到“治标治本”的作用。但由于核酸分子本身的局限性,如易降解、难以入胞等,克服这些内在缺陷是该领域药物研发的主要难题。不断创新科学理念,设计新机制、新结构核酸分子,为抗酶解、递送、治疗效价等关键科学问题提供崭新解决思路,有助于其实现跨越式突破。在本研究中,聚焦反义核酸,以提高抗酶解稳定性、细胞摄取率selleck NMR等为目标,应用多种修饰策略,设计新结构新机制反义核酸药物。方法:以抗肿瘤为研究模型,共设计三种新机制新结构反义寡核苷酸分子,包括:基于动态构象转化策略的哑铃型反义寡核苷酸前药;茴香酰胺-反义寡核苷酸缀合物;负载阿霉素发夹构象茴香酰胺-反义寡核苷酸前药。我们利用~1H-NMR和MS对其结构确证,圆二色谱与T_m值对其二级结构进行确证,并且模拟血清与DNase Ⅰ酶对其抗酶解能力进行验证其抗酶解稳定性,利用共聚焦荧光实验和流式细胞术实验对其细胞摄取能力进行验证,利用体外抗肿瘤实验(如肿瘤细胞抑制实验、细胞凋亡实验和RT-qPCR实验等)对其进行肿瘤抑制活性评价,接下来,对其进行体内抗肿瘤活性实验进一步验证其抗肿瘤活性。结果:1.基于动态构象转化策略的哑铃型反义寡核苷酸前药设计与评价。我们提出了一种具有哑铃型构象和响应开关功能的新型反义寡核苷酸前药。该反义寡核苷酸可以在溶液退火条件下通过自组装形成“哑铃型”构象反义核酸前药。当处于“哑铃型”构象时,由于反义序列两端被发夹构象保护,能够有效提高抗核酸酶降解能力。当前药分子进入肿瘤细胞后,高浓度的谷胱甘肽环境会导致响应开关区(二硫键)断裂,“哑铃型”构象转化成“链型”构象,释放出反义功能区即“原药”,进而识别并结合至靶m RNA发挥治疗作用。本部分工作通过MALY-188011小鼠LDI-TOF-MS鉴定序列准确,通过一系列降解实验(血清与DNase Ⅰ酶)表明,相较于天然或单端发夹型反义核酸前药,哑铃形反义寡核苷酸前药具有更高的抗酶降解稳定性。通过模拟肿瘤的还原微环境条件,二硫键会发生断裂,并解离出天然的反义寡核苷酸。哑铃型反义寡核苷酸前药在体外和体内都较天然寡核苷酸提高了抗肿瘤活性(p<0.05)。2.茴香酰胺-反义寡核苷酸缀合物设计与评价。本部分工作中,我们设计了一种茴香酰胺-反义寡核苷酸缀合物,其中茴香酰胺配体分子对肿瘤细胞表面Sigma受体具有高亲和力,在反义寡核苷酸上修饰茴香酰胺分子有助于增加肿瘤细胞对反义寡核苷酸的摄取,从而可以提高治疗效价。本工作利用硫代寡核苷酸修饰的硫醇位点,与羰基溴化物修饰的茴香酰胺配体分子,实现在溶液条件下高效和位点选择性的反应连接。通过~1H-NMR和MS验证羰基溴化物配体分子结构正确,并且通过MALDI-TOF-MS验证配体与反义寡核苷酸连接成功。通过体外稳定性实验、细胞摄取实验和体外抗肿瘤活性实验发现,反义寡核苷酸上的茴香酰胺配体分子的连接位点与连接数量对其抗酶解稳定性和抗肿瘤活性均具有影响。其中双端茴香酰胺配体缀合的反义寡核苷酸(T6)具有更好的抗酶解性、细胞摄取能力(p<0.05)与抗肿瘤活性(p<0.05)。进一步通过体内外抗肿瘤活性实验验证了T6具有较好的抗肿瘤活性。3.负载阿霉素发夹构象茴香酰胺-反义寡核苷酸前药设计与评价。根据之前课题autoimmune uveitis组的研究,带有发夹结构的反义寡核苷酸前药可以提高其抗酶解能力,并带来较好的抗肿瘤活性。在其基础上,本部分工作进一步设计,在发夹序列区末端引入茴香酰胺配体,并且利用发夹结构中的双螺旋作为药物载体,负载蒽环类药物,以达到多机制协同治疗肿瘤作用。在本部分工作中,通过质谱和荧光分光光度计确证功能分子的结构准确,阿霉素(DOX)作为负载药物可以成功与反义前药形成复合物。此复合功能分子可在高还原性肿瘤微环境中发生二硫键断裂,“发夹型”构象转化成“链型”构象,“原药”和DOX也随着释放。通过共聚焦显微实验进一步验证了茴香酰胺起到促进细胞摄取作用。通过体内外抗肿瘤活性实验验证了优选分子相较于天然寡核苷酸提高了抗肿瘤活性(p<0.05)。结论:综上所述,本课题以解决核酸药物入胞能力、稳定性等科学问题为目的,将动态构象转化与缀合物概念融入反义寡核苷酸结构中,设计三类新结构新机制核酸药物。本研究以核酸为基础疗法的新设计更好地提高寡核苷酸的稳定性与生物有效性。