植物细胞壁是地球上最丰富的生物质资源,木质纤维素是植物细胞壁的主要成分。木质纤维素由纤维素、半纤维素和木质素组成,其完全降解需要多种木质纤维素降解酶的协同作用。木质纤维素降解酶在茶叶及果汁增香、酿造、烘焙、功能性食品原料的生产、食品工业废弃物的处理等食品加工领域具有重要的应用价值。在自然条件下,细菌和真菌群落可以分泌一系列木质纤维素降解酶,并在食品工业中发挥重要的作用。但酶的生产成本高、水解效率低、稳定性差、功能单一,且大部分使用的酶均为单功能酶,限制了木质纤维素的有效利用。因此,高效、稳定、多功能的木质纤维素降解酶的开发、高效省时的蛋白纯化及固定化方法等方面的研究具有重要意义。多功能酶可以同时作用于不同的底物,与单一功能酶相比减少了水解反应所需的酶的种类和数量,极大地降低了酶的成本,因此对于多功能酶的研究比单一功能酶更具吸引力,尤其是参与半纤维素降解的多功能酶。本研究中,首先通过蛋白质末端氨基酸截短的方法确定了栖瘤胃普雷沃氏菌双功能木聚糖酶/阿魏酸酯酶Xyn-Fae的功能域,构建了新型双功能酶。该酶与纤维素酶协同作用大幅提升了木质纤维素的降解效率,并释放阿魏酸、低聚木糖、还原糖等功能性物质,在食品加工领域具有重要的应用价值。随后,将ELP-intein纯化策略和芽孢表面展示技术应用于新型双功能酶的纯化和固定化,在简化蛋白纯化过程、降低纯化成本的同时提高了酶的活性与稳定性,突破了双功能酶应用的技术瓶颈,并拓展了上述新技术的应用范围。最后,成功构建了新型多功能融合酶GXF,并首次将多功能酶应用于龙井茶的品质提升。GXF具有β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶多种活性,通过多酶协同作用能够显著地促进龙井茶香气的改善,提高龙井茶汤中的生物活性物质,为茶叶品质提升提供了新思路。此外,新型多功能酶的构建对于酶工程和食品酶法处理等领域的研究具有重要的借鉴价值。主要研究结果如下:(1)揭示了Xyn-Fae的功能域,构建了新型双功能木聚糖酶/阿魏酸酯酶Xyn Ⅱ-Fae,其与纤维素酶能够高效地协同降解木质纤维素。Xyn Ⅱ-Fae和商业纤维素酶之间存在显著的协同水解作用,当二者以4:6的比例添加到脱木质素玉米秸秆中,还原糖的释放量比单独使用纤维素酶提高了65%,木聚糖和葡聚糖的转化率分别提高了125.1%和54.3%。此外,Xyn Ⅱ-Fae可以促进商业纤维素酶对脱木质素小麦秸秆、甘蔗渣等农业木质素生物质底物的降解,释放出还原糖、阿魏酸、低聚木糖等功能性物质。(2)基于CX-5461小鼠ELP-intein和His-ELP-intein标签实现了Xyn Ⅱ-Fae的高效表达和简易纯化。为简化蛋白纯化流程,节约纯化时间及成本,构建了基于ELP-intein标签的无需亲和层析的蛋白纯化系统,以及基于His-ELP-intein标签的无咪唑及高浓度盐的蛋白纯化系统,分别对双功能酶Xyn Ⅱ-Fae进行了纯化。ELP-intein-Xyn Ⅱ-Fae的最优纯化条件为(NH_4)_2SO_4浓度为0.5 mol·L~(-1),相变温度为31.2℃,在42℃下绝大部分蛋白均可以被沉淀出来。His-ELP-intein-Xyn Ⅱ-Fae最优纯化条件为(NH_4)_2SO_4浓度0.4 mol·L~(-1),购买IDN-6556相变温度为34.1℃。利用His-ELP-intein标签纯化获得的Xyn Ⅱ-Fae,在蛋白浓度及酶活性方面要明显优于ELP-intein。(3)建立枯草芽孢杆菌芽孢表面展示系统,提高了Xyn Ⅱ-Fae的稳定性和循环利用性。为了提高Xyn Ⅱ-Fae的稳定性、易分离、可循环使用等特性,以枯草芽孢杆菌的芽孢为固定化基质,构建了基于芽孢表面吸附和共价结合的展示系统。通过Western blot、以及不同蛋白酶处理等检测方法证明了吸附和共价结合的方法均可使Xyn Ⅱ-Fae成功展示在芽孢表面并进行表达。芽孢表面对Xyn Ⅱ-Fae的共价结合效率为69.96%,明显高于表面吸附的固定化效率(36.66%),且共价结合的Xyn Ⅱ-Fae在广泛的p H和温度范围内表现出比游离酶更高的活性和稳定性。(4)在Xyn-Fae基础上构建了多功能融合酶,该酶具有β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶活性,对木质纤维素有协同降解作用。为增加酶的活性功能,在Xyn-Fae的基础上通过柔性连接肽(GGGGS)_3的连接,融合了来源于嗜热放线菌(Thermobifida fusca)的β-葡萄糖苷酶基因,构建β-葡萄糖苷酶/木聚糖酶/阿魏酸酯酶多功能融合酶(β-Glu-Xyn-Fae)。N末端融合酶GXAntibody ServicesF各部分与底物的亲和力以及催化效率均优于亲本酶,C末端融合酶XFG的β-Glu部分催化效率优于亲本酶,但木聚糖酶、阿魏酸酯酶以及乙酰木聚糖酯酶的催化效率与亲本酶相比有所降低。GXF的各种酶发挥功能的最适条件和稳定性非常相似,且各部分之间存在着较强的协同作用,能够有效地促进玉米秸秆、小麦秸秆及甘蔗渣等农业废弃物的降解。(5)多功能融合酶GXF能够通过多酶协同作用,丰富茶叶内质,显著提升茶品质。采用顶空固相微萃取结合GC-MS、LC-MS/MS、HPLC等检测技术探究多功能融合酶对龙井茶香气改善以及茶品质提升的影响。结果表明多功能融合酶GXF的β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、阿魏酸酯酶以及乙酰木聚糖酯酶活性之间具有高效的协同作用。GXF能够显著地促进龙井茶香气的提升,提高龙井茶汤中阿魏酸、低聚木糖及还原糖的含量,促进茶汤中黄酮苷的转化,增加茶汤中的生物活性物质,使得茶叶的内质更为丰富,茶品质更高。