冠状病毒是一类具有包膜的单链正向RNA病毒,它广泛地存在于自然界当中,能引发人和动物的呼吸道、肠道和中枢神经相关疾病。纵观冠状病毒的流行病史,冠状病毒呈现着感染性强、致死率高的趋势,严重威胁着人和动物的生命安全。目前,主蛋白酶和刺突蛋白是抗病毒药物研发的主要靶标,主蛋白酶(main protease,M~(pro))是冠状病毒在复制期时的关键酶,负责切割非结构蛋白nsp4-nsp16,并且具有较高的同源性以及较为保守的催化机制,因此M~(pro)是设计和开发广谱抗病毒药物的一个有效靶标。二聚体为主蛋白酶的活性状态,溶液中为单体和二聚体的解离平衡,其活性呈浓度依赖性,即浓度越高,二聚体状态越多。目前,大多数主蛋白酶的药物研发都是集中于二聚体M~(pro),为了抑制M~(pro)的早期状态,需要分析单AMG510体的构象,然而天然单体结构尚未有人报道。我们认为靶向其折叠过程是抑制M~(pro)发挥功能的有效替代方法。由于M~(pro)容易在高浓度下形成二聚体结晶,很难获得天然的单体M~(pro)的结构。来自骆驼类单域抗体的纳米抗体(NB)具有体积小、稳定性高、亲和力强等独特的特性。通过将相对较长的第三互补决定区(the third complementarifeline infectious peritonitisty determining region,CDR3)插入抗原缝隙中来捕捉蛋白质构象变化的中间状态。因此,利用纳米抗体作为结晶的辅助工具来捕捉SARS-CoV-2主蛋白酶的单体特异性构象,以此来阐明M~(pro)的成熟、二聚化和活性机制。刺突蛋白上的受体结合域(RBD)能够与细胞表面受体ACE2结合,是冠状病毒进入细胞的首要步骤,RBD中和性抗体是快速治疗冠状病毒疾病的首选方案,筛选到多种不同结合表位的抗体对于抗病毒药物的研发提供了更多的思路。新冠病毒具备高突变性的特点,而突变最活跃的部位是其受体结合域,对其抗体的开发更是能够筛选到特殊的结合表位,对未来突变体的抗病毒药物研发提供新的、更高效的靶点。主要研究内容如下:(1)功能性纳米抗体的筛选:对双峰驼进行抗原免疫,以噬菌体展示技术筛选到不同CDR3区域的纳米抗体,使用生物层干涉仪(BLI)测定纳米抗体的亲和力,获得11个高亲和力纳米抗体,结合酶动力学方法对高亲和力纳米抗体的功能筛选,获得7个抑制性纳米抗体,以尺寸排阻色谱法进一步筛选功能,获得7个对活性二聚体主蛋白酶具有破坏能力的纳米抗体。同样以尺寸排阻色谱法,将抗原结合表位分为3类,选择两个非重叠表位的纳米抗体NB1A2和NB2B4进行蛋白结晶和结构解析,获得主蛋白酶的天然单体构象和纳米抗体的作用机制。(2)M~(pro)的变构机制:将抑制性纳米抗体NB1A2和NB2B4分别与二聚体M~(pro)蛋白共结晶,通过晶体衍射和结构解析,分别获得了1.7和2.0(?)的复合物结构,通过结构解析我们发现了主蛋白酶的两种新的构象,NB1A2所在的主蛋白酶构象类似于二聚体一个原聚体,呈现一种紧密构象,NB2B4所在的主蛋白酶构象中,NB2B4作用在主蛋白酶的C结构域,其催化结构域与C结构域分离,呈现一种延伸构象。两种构象的变化让我们认识到主蛋白酶的成熟机制,即主蛋白酶在成熟过程中经历单体展开状态到单体紧凑状态到二聚体构象这一过程,并且随着浓度的变化着三种状态存在动态平衡。它们的变构机制不同,NB1A2作用在主蛋白酶的催化活性位点,直接作为竞争性抑制剂抑制二聚化,另外N端的密度丢失以及C端的位点冲突以变构抑制的方式阻碍了蛋白的二聚;NB2B4所在的结构中,主蛋白酶的N指结构扭转,C端密度丢失,这些严重阻碍了酶的二聚化,NB2B4同样阻碍了C结构域的互作,也阻碍了单体构象自身催化结构域和C结构域的靠近,从MK-2206临床试验而抑制主蛋白酶二聚化。(3)基于Nano Bi T的SARS-CoV-2单体M~(pro)构象传感器的开发:根据发现的两种单体主蛋白酶构象,我们以荧光素酶技术为基础,将单体M~(pro)的N和C端分别连接荧光素酶片段Lgbit和Smbit,通过纳米抗体的变构作用设计筛选别构抑制剂的方法,根据此方法,首先对NB1A2和NB2B4成功进行了验证,最后从7个具有别构抑制性纳米抗体中筛选出具备锁定延伸构象的纳米抗体。(4)为了获得具有中和性的纳米抗体,同样以双峰驼免疫、纳米抗体筛选及抗原结合表位分类,获得了三类不同表位的纳米抗体,选择这三类表位进行蛋白的结晶和结构解析,其中NB1A7和NB1B11分别与RBD结晶,NB1B5和NB1C6与RBD共结晶,最终X-ray衍射和结构解析获得三个复合物结构,从结构上来看NB1A7、NB1B5和NB1C6作为较为保守的结合位点分别作用在RBD与ACE2结合位点的两侧,NB1B11直接作用在ACE2的结合位点周围。综上所述,我们新发现了由两个不同表位的纳米抗体捕获的SARS-CoV-2主蛋白酶天然单体的两种不同构象。一种构象称为延伸构象,催化结构域通过纳米抗体(NB2B4)与额外螺旋结构域分离,该状态是所有其他状态的前体。另一种类似于二聚体形式的紧密构象,并由另一种纳米抗体(NB1A2)稳定,后者是竞争性抑制剂,也是变构抑制剂。主蛋白酶在延伸构象、紧密构象和二聚体之间处于平衡状态,紧密态为中间态。单体的构象变化揭示了新的变构靶点,借助Nano Bi T,我们设计了一种基于构象重排的高通量变构抑制剂分析方法。我们的研究结果为深入了解冠状病毒主蛋白酶的成熟、二聚化和催化作用奠定了基础,通过靶向成熟过程,抑制主蛋白酶的自动水解,为广谱抗冠状病毒药物研发开辟一条新途径。三类抗原结合表位的纳米抗体与RBD的结构解析发现了两种保守结合位点和一种强力的中和性纳米抗体,保守的结合表位为突变体新冠病毒的药物研发提供了新的可能,同时也为现有的新冠病毒药物研发具有一定的参考意义。