玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)是一种霉菌毒素,在被霉菌污染的农作物和相关制品中检出率很高,严重威胁动物生产和人类食品安全。ZEA及其代谢物可诱导生殖毒性、免疫毒性、基因毒性和细胞毒性。畜禽对ZEA有明显不同的耐受性,猪是最易受影响的物种。代谢物及代谢通路对评估和控制真菌毒素诱导的毒性至关重要。ZEA对代谢过程产生毒性影响,包括核苷酸和蛋白质合成、活性氧化物质产生和脂质氧化,但是其潜在功能和分子机制仍不清楚。本研究通过检测ZEA对猪小肠上皮细胞(Porcine intestinal epithelial cell line,IPEC-J2)的细胞活性、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)以及凋亡的影响,初步探究ZEA对IPEC-J2细胞的毒性作用;通过转录组学和代谢组学测序联合分析,筛选细胞对ZEA毒性反应的调控基因、信号通路和生物活性代谢物;通过体外添加关键代谢物L-精氨酸(L-Arginine,L-Arg)探究其在缓解ZEA毒性中的作用及分子机制。本研究主要结果如下:1.基于转录组测序筛选玉米赤霉烯酮诱导猪小肠上皮细胞毒性的差异表达基因为了探究ZEA诱导的IPEC-J2细胞毒性,本研究使用浓度10μg/ml的ZEA处理IPEC-J2细胞,24h后利用CCK8试剂盒检测细胞活性,发现IPEC-J2细胞活性显著下降(P<0.01);利用流式细胞仪检测处理组与对照组的活性氧水平和细胞凋亡情况,发现ZEA处理组细胞的ROS水平和凋亡率显著升高(P<0.01)。上述结果证明ZEA诱导IPEC-J2细胞毒性模型构建成功。为了筛选ZEA诱导IPEC-J2细胞毒性的差异表达基因,本研究采用RNA-seq技术对ZEA处理组和对照组的样品进行转录组测序分析。差异表达分析共检测出5646个差异表达基因,其中2740个差异上调基因,2906个差异下调Empagliflozin基因。基因集富集分析(GSEA)显示,上调基因(如DND1、GLE1、NAT10、ISG20等)主要富集在核糖体生物发生(categoriesofribosome biogenesis)、ncRNA 加工(ncRNAprocessing)和核糖核蛋白复合物生物发生(ribonucleoprotein complex biogenesis)等生物过程中;下调基因(如CKMT1A、GAMT、SLC27A1、HOGA1等)主要富集在细胞修饰的氨基酸代谢过程(cellular modified amino acid metabolic process)、抗原加工和呈递(antigen processing and presentation)以及脂肪酸生物合成(fatty acid biosynthetic process)等生物过程中。层次聚类分析将差异表达基因分成4组,其中cluster1包含144个基因,其表达趋势在ZEA处理组显著降低,表明它们与ZEA处理呈负相关。功能富集分析显示,cluster1的144个基因在脂质代谢过程(lipid metabolism process)、类固醇生物合成和代谢过程(steroid biosynthesis and metabolism processes)以及蛋白质转运类别(protein transport categories)中显著富集。此外,随机选择11个差异表达基因(OASL MX2,SERPI,GDPD2等)进行qRT-PCR验证,结果表明这些基因的表达趋势与RNA-seq分析一致,说明RNA-Seq数据分析的准确性和可靠性。2.整合分析筛选玉米赤霉烯酮诱导猪小肠上皮细胞毒性的差异代谢物及相关基因为了筛选ZEA诱导IPEC-J2细胞毒性的差异代谢物,本研究用液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)在正离子和负离子模式下对ZEA处理组与对照组进行代谢组分析。代谢物分类表明,所有的代谢物主要属于脂类和类脂类分子(lipiAdavosertib分子式ds and lipid-like molecules),有机酸及其衍生物(organic acids and derivatives)和有机杂环化合物(organoheterocyclic compounds)等10类。代谢物差异分析表明,正离子模式下ZEA处理组与对照组之间差异代谢物筛选出213种,其中81种代谢物上调,132种代谢物下调;负离子模式下两组间的差异代谢物筛选出112种,其中18种代谢物上调,94种代谢物下调。富集分析结果表明差异代谢物在甘油磷脂代谢(glycerophospholipid metabolism),抗坏血酸和醛酸代谢(ascorbateand aldaratemetabolism),丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(alanine,aspartate and glutamate metabolism)以及精氨酸生物合成(arginine biosynthesis)等通路中显著富集。转录组与代谢组联合分析结果表明差异代谢物和基因在脂质代谢(lipid metabolism)、氨基酸代谢(amino acid metabolism)和碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)通路中显著富集。其中属于氨基酸代谢的精氨酸和脯氨酸代谢以及精氨酸生物合成的两个紧密联系的通路被富集,且ZEA处理组参与这两种通路的大多数基因和检测到的代谢物下调,表明ZEA可能通过干扰精氨酸合成和代谢过程对细胞产生毒性作用。3.L-精氨酸缓解玉米赤霉烯酮诱导的猪小肠上皮细胞毒性的分子机制为了探索L-精氨酸(L-Arg)对ZEA诱导的IPhepatic insufficiencyEC-J2细胞毒性的潜在影响,本研究采用不同浓度的L-Arg(20～450μM)作为外源物质加入ZEA处理的IPEC-J2细胞中,24h后发现ZEA处理的细胞活性显著升高,但是加入的L-Arg浓度大于200μM时细胞活性下降。进一步对活性氧和细胞凋亡的检测发现,添加80μM和200μM的L-Arg可显著降低ZEA处理细胞的ROS水平和凋亡率(P<0.01)。以上研究表明L-Arg的添加能够缓解ZEA对IPEC-J2细胞造成的毒性作用。为了探索L-Arg缓解ZEA对IPEC-J2细胞毒性的潜在分子机制,本研究通过ELISA试剂盒检测L-Arg对ZEA代谢代谢的影响,发现添加L-Arg的细胞中ZEA的浓度显著降低(P<0.01)。通过qRT-PCR检测L-Arg对编码解毒酶基因和抗氧化酶相关基因表达的影响,发现Ⅱ期解毒基因SULT2B1、GSTA1和GSTM3的表达在ZEA处理组显著降低,抗氧化酶相关基因GPX4的表达显著升高,且L-Arg可显著促进这些基因的表达(P<0.01)。通过Western blot检测添加L-Arg后细胞的自噬水平,结果显示LC3-Ⅱ水平增加,p62/SQSTM1水平下降,自噬相关蛋白Beclin1水平增加,表明自噬通路被激活。进一步利用自噬体-溶酶体融合抑制剂Bafa(0.1μM)抑制细胞自噬后发现L-Arg对ZEA诱导的细胞凋亡缓解作用被明显抑制(P<0.01)。综上结果证明,L-Arg能够通过影响解毒过程和自噬通路来缓解ZEA诱导的细胞毒性。综上所述,本研究成功构建ZEA诱导猪小肠上皮细胞毒性损伤模型,通过转录组与代谢组测序分析筛选了差异表达基因和差异代谢物,通过整合分析筛选到关键差异代谢物L-精氨酸可以缓解ZEA诱导的细胞毒性。