γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种四碳的非蛋白质氨基酸,具有多种生理生化功能,在医药、化工、食品添加等领域有着广泛应用。作为食品安全菌株,谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)在工业上可用于L-谷氨酸及其衍生物的大量生产。为实现利用谷氨酸棒杆菌高效合成γ-氨基丁酸,本研究通过理性设计催化产物前体生成的谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,GDH)提高了酶在生产条件下的活力,强化了生产菌株合成谷氨酸的能力。在此基础上,理性设计生产限速酶谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)改善了酶p H特性,进一步结合代谢改造手段,获得了γ-氨基丁酸产量及生产效率提高的重组谷氨酸棒杆菌。研究结果为实现其规模化工业生产奠定了基础。主要研究结论如下:(1)不同来源谷氨酸脱氢酶的筛选及理性设计。本研究从7种不同来源的谷氨酸脱氢酶出发,合成基因后通过载体p ET-28a在E.coli BL21(DE3)中异源表达,SDS-PAGE验证发现蛋白皆成功表达。纯化蛋白测定各酶的酶学性质,发现各来源酶最适p H基本位于碱性范围,其中木聚糖兼性芽孢杆菌(Amphibacillus xylanus)来源的酶最适p H为8.5,最大比活力273.06±6.48 U·mg~(-1),仅次于谷氨酸棒杆菌来源的酶。根据辅酶依赖性及酶比活力选取木聚糖兼性芽孢杆菌来源的谷氨酸脱氢酶为对象,利用Rosetta软件Supercharge算法对其进行理性设计,得到突变点V55D,S150D,T188D,R255D,L257D,Q282D,L302E,K314E,R344E,T389E共10个位点。构建相应重组大肠杆菌,考察特定p H下单点突变酶的相对活力大小,组合有益突变点得到了最优组合突变酶Ax GDH~(S150D/T188D/L257D/L302E)。酶学性质测定和分子动力学模拟比较最优组合突变酶与野生酶在最适条件、稳定性及底物结合等方面的差异。结果显示突变酶最适p H下调1.5个单位,酶比活力得到提升。(2)谷氨酸棒杆菌中谷氨酸脱氢酶编码基因的整合,提高谷氨酸积累量。将上述木聚糖兼性芽孢杆菌来源野生酶及突变酶(Ax GDH~(S150D/T188D/L257D/L302E))的编码基因构建到生产菌C.glutamicum E01敲除整合载体p K18mobsac B上。电击转化、蔗糖筛选后获得整合菌株C.glutamicum E01::axgdh和C.glutamicum E01::axgdh~(S150D/T188D/L257D/L302E)。以葡萄糖为碳源,在5 L发酵罐中补料发酵96 h后,整合菌株C.glutamicum E01::axgdh~(S150D/T188D/L257D/L3Tumor immunology02E)谷氨酸积累量高达115.0 g·L~(-1)。(3)谷氨酸脱羧酶的酶学性质测定及理性设计。从实验室一株高产γ-氨基丁酸的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum HG-06)中克隆谷氨酸脱羧酶编码基因,通过构建重组载体p ET-28a-lpgad在E.coli BL21(DE3)中异源表达Lp GAD酶。测定酶的酶学性质后发现该酶最适p H为4.8且催化反应发生的p H范围较窄。以该酶为对象,利用上述Rosetta软件对其进行理性设计。得到突变点S24R,D88R,L135K,E170R,H196R,A225K,Y309K,A359R,E417K共9个位点。构建相应重组大肠杆菌,考察特定p H下各突变体相对活力大小,得到了最优组合突变酶Lp GAD~(S24R/D88R/MRTX1133 MWY309K)。通过酶学性质测定和分子动力学模拟比较最优组合突变酶与野生酶在最适条件、稳定性及底物结合等方面的差异。结果显示Lp GAD~(S24R/D88R/Y309K)在作用p H区间下的活力得到整体提升,p H 6.0时酶比活力是野生酶的1.68倍且酶作用的p H区间拓宽了0.5个单位。(4)重组谷氨酸棒杆菌发酵法及全细胞转化法生产γ-氨基丁酸。通过穿梭质粒p XMJ19BMN 673作用在上述整合菌C.glutamicum E01::axgdh~(S150D/T188D/L257D/L302E)中分别表达Lp GAD及其最优突变酶,实现谷氨酸棒杆菌从无到有发酵积累γ-氨基丁酸。采用两阶段p H调控策略,在5 L发酵罐中补料发酵96 h后,重组菌γ-氨基丁酸产量最高为32.14 g·L~(-1),葡萄糖到γ-氨基丁酸的转化率为11.94%。因发酵法制备γ-氨基丁酸产量较低,通过穿梭质粒p XMJ19在C.glutamicum E01中分别表达Lp GAD及其最优突变酶,摇瓶优化后确定了转化最适温度为40℃,5’-磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate,PLP)添加量为100μmol·L~(-1),底物L-谷氨酸为100.0 g·L~(-1),菌体量OD_(600)为20。C.glutamicum E01/p XMJ19-lpgad和C.glutamicum E01/p XMJ19-lpgad~(S24R/D88R/Y309K)在最优条件下于5 L罐中分批转化谷氨酸,γ-氨基丁酸产量分别达到247.1 g·L~(-1)和402.8 g·L~(-1)。