研究背景:微小染色体维持蛋白5(minichromosome maintenance proteins 5,MCM5)是微小染色体维持蛋白家族(minichromosome maintenance proteins,MCMs)的成员,MCMs主要包括了MCM1-10,其中MCM2-7在真核生物及古细菌中都有被发现,且MCM2-7蛋白彼此之间的序列明显相似,其相互作用共同构成MCM复合物六聚体,在真核生物的基因复制中发挥作用。MCM5主要参与DNA的复制起始的解旋与复制叉的延伸,而MCM5在细胞中的含量远超其复制过程所需的量,随后发现MCM5也参与RNA转录过程。目前MCM5研究主要集中在肿瘤的发病机制中,MCM5的异常表达与许多肿瘤的诊断、治疗及预后都密切相关。MCM5缺失也可导致神经系统及胚胎发育障碍。近年有文献报道MCM5具有年龄依赖性,在细胞衰老中也发挥着关键作用。然而MCM5在脑中的定位仍不清楚,因此本项目将探索MCM5在小鼠脑中的分布,为MCM5在中枢神经系统中的作用机制研究提供形态学参考。研究目的:探索MCM5在小鼠脑中的表达定位及表达的细胞类型,探讨MCM5在小鼠及藏酋猴脑中的物种表达差异性,为后续研究MCM5在脑发育及疾病中的作用奠定基础。材料与方法:1.选用C57/BL6雄鼠,进行心脏灌注取脑、后固定及脱水、脑冠状面冰冻切片,使用MCM5兔源单克隆抗体标记脑切片,进行免疫荧光染色,荧光显微镜扫描脑切片,观察MCM5在小鼠脑中的表达定位;选取已固定的藏酋猴部分脑区进行石蜡包埋切片,正置荧光显微镜观察藏酋猴部分脑区中MCM5的表达。2.将小鼠脑组织进行石蜡包埋及切片,使用MCM5兔源单克隆抗体分别与鼠源抗神经元核抗原抗体(Neu N,神经元标记物)、抗少突胶质细胞转录因子2抗体(OLIG2,少突胶质细胞标记物)、离子钙接头蛋白1抗体(Iba1,小胶质细胞标记物)、抗神经胶质纤维酸性蛋白抗体(GFAP,星形胶质细胞标记物)、酪氨酸水解酶抗体(TH,多巴胺能神经元标记物)、抗胆碱乙酰转移酶抗体(CHAT,胆碱能神经元标记物)、囊泡型谷氨酸转运体-1抗体(VGLUT1,谷氨酸能神经元标记物)、谷氨酸脱羧酶67抗体(GAD67,γ-氨基丁酸能神经元标记物)进行共同免疫荧光染色,荧光显微镜观察MCM5在小鼠不同类型神经元及神经胶质细胞中的表达。3.选用C57/BL6野生型3月龄成年雄鼠及18月龄老年雄鼠,进行心脏灌注取脑、后固定及脱水、石蜡切片,使用MCM5兔源单克隆抗体分别标记成年小鼠、老年小鼠脑石蜡切片,观察MCM5在不同年龄中的表达。4.选用C57/BL6野生型3月龄成年雄鼠及18月龄老年雄鼠,提取小鼠大脑皮层、纹状体、海马、丘脑、中脑五个脑区的蛋白,BCA法测蛋白浓度,使用蛋白印迹检测比较成年与老年小鼠这五个脑区的MCM5蛋白含量,并进行统计学分析。结果:1.MCM5阳性信号在小鼠大脑中广泛分布,在嗅脑的突触球层/小球周细胞层(GI)、外丛状层(EPI)、前嗅区(AO)、大脑皮质(Cortex)的腹侧眶皮质(VO)、外眶皮质(LO)、眶内侧皮质(MO)、次级运动皮质(M2)、岛叶皮质(AI)、梨状皮质(Pir)及其1-3层、梨状核(En)、初级感觉皮质(S1)、次级感觉皮质(S2)、初级运动皮质(M1)、扣带皮质29C区域(A29C)、初级视皮质(V1)、次级视皮质外侧(V2L)、次级听皮质(Au D)、初级听皮质(Au1)等、大脑基底核的纹状体的尾状核(CPu)、苍白球(VP)等、隔区的伏隔核(Acb)、中间隔核(MS)、斜角带核(VDB)等、海马结构的海马锥体层(Py)、海马乳头分子层(Lmol)、齿状回(DG)等区域阳性信号较明显。在嗅脑的颗粒细胞层(Gro)、胼胝体(cc)及胼胝体小钳(fmi)、外囊(ec)未观察到MCM5阳性信号。随后我们选择性观察了嗅脑的GI、AO、大脑皮质的M2、LO、En、隔区的Acb、基底核的CPu、VP、海马结构的DG、Py局部区域,发现MCM5在细胞核及核周细胞质中呈点状阳性。2.MCM5阳性标记在小鼠间脑中也广泛分布,在丘脑的室旁核(PVA)、中央内侧核(CM)、前背侧核(AD)、丘脑网状核(Rt)、外侧背核(LDDM)、腹外侧核(VL)、腹后外侧核(VPL)、腹内侧核(VM)、腹后内侧核(VPM)、丘脑下核(Sub)、后丘脑的背侧膝状体核(DLG)、上丘脑的髓纹(sm)、缰核(Hb)、外侧下丘脑(LH)、下丘脑前侧(AHA)、底丘脑的底丘脑核(STh)等脑区观察到较强的阳性标记。接着我们观察了丘脑的外侧背核(LDDM)、腹外侧核(VL)、中央内侧核(CM)、上丘脑的髓纹(sm)、下丘脑前侧(AHA)、底丘脑核(STh)、后丘脑的背侧膝状体核(DLG)局部区域,发现MCM5在细胞核及核周细胞质中呈点状阳性。3.在小鼠脑干中也发现了广泛分布的MCM5阳性信号,脑干中阳性信号较明显的区域为中脑的顶盖前核(APTD)、顶盖腹前核(APTV)、腹侧被盖区(VTAR)、黑质(SN)、导水管周围核群(DK)及导水管周围灰质(PAG)pre-formed fibrils、红核(RPC)、脚间核(IP)、被盖核(Tg)、下丘的皮质(CIC)、脑桥的脑桥核(Pn)、脑桥网状核(Pn C)、脑桥网状被盖核(Rt Tg)、三叉神经主支(Pr5VL)、前庭神经核(VE)、面神经核(7N)等区域。在中脑的导水管周围核群(DK)、红核(RPC)、脚间核(IP)、被盖核(Tg)及脑桥的网状被盖核(Rt Tg)、前庭神经核(VE)、面神经核(7N)区域的细胞核及核周细胞质中MCM5呈点状阳性表达,在黑质(SN)中MCM5呈胞质内弥漫强阳性。4.在小鼠小脑中MCM5的阳性信号也分布广泛,阳性信号较强的在小脑的蚓叶(cb)、小脑间位核(Int A)、小脑外侧神经核团(Lat)及内侧核(med)等部位,并且我们观察了小脑的这四个部位,发现MCM5在细胞核周围呈点状阳性。5.在藏酋猴大脑皮质、海马结构、纹状体、中脑黑质、丘脑中均发现MCM5阳性信号。6.MCM5与Neu N在大脑皮质及丘脑神经元的细胞核及细胞质中均共标,在海马及黑质神经元的细胞质中共标。MCM5与TH在黑质的多巴胺能神经元的细胞质中呈弥漫阳性。MCM5与CHAT在大脑皮质及海马的胆碱能神经元的细胞质中共标;在纹状体与斜角带核,MCM5在CHAT标记的胆碱能神经元的细胞核中为阳性CB-839。MCM5与VGLUT1在海马、纹状体及丘脑的谷氨酸能神经元的细胞质中均共标,但在大脑皮质中谷氨酸能神经元的细胞核及细胞质中均表达。MCM5在大脑皮质、纹状体、海马的γ-氨基丁酸能神经元的细胞质及细胞核中均存在阳性信号,在下丘脑后核,MCM5与GAD67标记的γ-氨基丁酸能神经元共标于细胞质。MCM5与OLIG2在大脑皮质、中脑黑质、面神经核(7N)、丘脑这四个脑局部区域的少突胶质细胞的细胞质中共标。MCM5与Iba1在小鼠大脑皮质、海马、纹状体、中脑黑质的小胶质细胞的细胞质中共标。MCM5与GFAP在大脑皮质、海马、纹状体、中脑黑质的星形胶质细胞中均不共标。7.我们通过免疫荧光染色发现MCM5阳性信号在正常成年及老年小鼠的大脑皮质、纹状体、海马、丘脑、黑质均存在,但在老年小鼠中MCM5阳性信号均明显较成年小鼠强,蛋白质免疫印迹再次证明了老年小鼠中表达均较成年小鼠高。结论:1.MCM5在小鼠脑中广泛存在,在嗅球部分区域、大脑皮质、大脑基底核、隔区、海马结构、丘脑、下丘脑、后丘脑、底丘脑、中脑及小脑等部位呈弥漫阳性,尤其在黑质致密INCB018424部呈明显特异的胞质内弥漫强阳性表达,在嗅球的颗粒细胞层、胼胝体、外囊处未见MCM5阳性标记。这表明MCM5在脑中可能存在较为广泛的作用,尤其在黑质处可能存在较为特异的功能;在藏酋猴的大脑皮质、纹状体、海马、丘脑、黑质中MCM5也均表达,说明在这两种物种之间MCM5的表达具有保守性。2.MCM5在神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞、胆碱能神经元、谷氨酸能神经元、γ-氨基丁酸能神经元、多巴胺能神经元中均存在,但在不同脑区的同一类型的神经细胞中,MCM5阳性信号既可能只存在于细胞核或者细胞质中,也可能在细胞核及细胞质中均存在。MCM5在多巴胺能神经元胞质内表达呈相对特异的胞质内弥漫强阳性,表明MCM5在多巴胺能神经元中可能存在更为特异的作用。MCM5在星形胶质细胞中为阴性。3.MCM5在正常成年及老年小鼠的大脑皮质、纹状体、海马、丘脑、黑质均表达,但MCM5在老年小鼠表达均明显较成年小鼠高,蛋白质免疫印迹再次验证了这个结论,说明其表达具有年龄差异性。