【研究背景】青光眼是一种不可逆的致盲性眼病,以病理性眼压(Intraocular pressure,IOP)增高、视力下降、视野窄缩以及视乳头凹陷、视神经萎缩为主要临床表现。其病理改变主要是视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cells,RGCs)及其轴突的变性、萎缩、丧失,最终导致视功能的永久性损害。原发或继发的病理性高眼压和视乳头缺血缺氧是青光眼发病的主要危险因素,临床上青光眼治疗以药物和手术控制降低眼压为主,而有证据表明,持续的视神经损害仍然出现在部分眼压得到良好控制的患者身上。随着对青光眼发病机制的研究深入,研究人员逐渐形成共识:既然RGCs的丢失是导致青光眼视神经损伤的重要病理改变,积极寻求一种新的手段尽可能挽救渐进性丢失的轴突,阻止RGCs死亡,开发神经保护型药剂,减缓甚至逆转青光眼性视神经变性的进程,才是未来青光眼综合防治的重中之重。青光眼患者眼局部存在异常活跃的免疫调节这一发现近年来日益受到重视。小胶质细胞,作为中枢神经系统(Central nervous system,CNS)中留驻的巨噬细胞,长期以来承担着向免疫系统呈递抗原的职责。眼部小胶质细胞拥有类似调节能力,青光眼早期,视网膜小胶质细胞即活化并迁移到视网膜内层,并在RGCs附近募集增殖。小胶质细胞通过清除退化的RGCs及其轴突的碎片和分解有害产物,在青光眼发病中发挥免疫调节作用,另一方面,应激状态下,不受控的免疫炎症和细胞因子风暴不可避免的成为神经元二次损害的主因。焦亡(Pyroptosis),又称细胞炎性坏死,是一种新发现的细胞程序性死亡方式。细胞焦亡时胞膜破裂,释放内源性危险信号——损伤相关分子模式(Damage associatedMedically-assisted reproduction molecular patterns,DAMPs),募集IL-1β、TNF-α等炎症因子并诱导神经元继发性损伤,级联反应导致病变部位的炎症扩散到周围组织,导致细胞死亡,同时抑制组织的自发再生和功能恢复。在细胞焦亡期间,半胱氨酸蛋白酶-1前体(Pro-CASP1)通过连接蛋白ASC(包含CARD域细胞凋亡相关斑点样蛋白)与模式识别受体间接连接,形成大分子复合物,称为炎症小体,其中由NOD样家族受体蛋白3(NLRP3)、ASC与Caspase-1组成的多蛋白复合体被称为NLRP3炎症小体。炎性体激活并裂解Pro-CASP1以形成活性Caspase-1剪切体,可以切割焦亡效应蛋白Gasdermin D(GSDMD)以形成活性N端和C端部分,N端产物促进细胞膜穿孔和细胞死亡,并扩大炎症反应,因此焦亡也被称为最促炎的细胞死亡类型,与免疫炎症密切相关。中草药川芎,作为“血中气药”,具有活血行气,祛风止痛等作用,被广泛应用于各类瘀滞不通之“痛症”,亦是古籍记载中治疗内障眼疾常用药。川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP),是川芎干燥根茎的提取物,富有多种生物活性,如抗氧化自由基、抗炎、抗肿瘤、钙拮抗、改善血流动力学等功效,其注射制剂目前在心脑血管疾病领域已有成熟运用。TMP参与抑制中枢小胶质细胞活化,减轻中枢神经炎性反应,发挥神经保护作用,但缺乏依据表明其在青光眼视神经病变领域依然能发挥神经保护效应。本研究聚焦实验性慢性青光眼模型高眼压状态下TMP干预对视网膜小胶质细胞焦亡通路激活及表型极化的影响,寻求一种通过NLRP3炎症小体调控小胶质细胞焦亡保护视网膜神经节细胞的可能性,为川芎嗪治IACS-10759作用疗青光眼视神经病变提供参考,为青光眼临床中西医联合用药提供思路。【研究目的】1.构建大鼠慢性高眼压模型,观察高眼压环境对视网膜小胶质细胞炎性活化和表型极化的影响。2.探索视网膜小胶质细胞炎性激活对NLRP3/caspase-1/GSDMD通路的影响。3.初步探讨TMP通过调控NLRP3/caspase-1/GSDMD通路介导细胞焦亡以保护RGCs的可能性。【研究方法】51只SD大鼠被随机分成4组:空白对照(Ctrl)组,慢性高眼压模型(COH)组,COH+低剂量(40mg/kg)TMP组,COH+高剂量(80mg/kg)TMP组。通过前房注射2%甲基纤维素(20mg/ml)构建大鼠慢性高眼压模型。除Ctrl组以外,每组大鼠右侧眼球施以前房注射术,对侧眼球不作处理以作自身正常眼压基线对照参考。TMP给药组在术后第2天即予腹腔注射相应剂量的盐酸川芎嗪注射液,给药频率每隔天一次,Ctrl组和COH组同给药组以相同频率予等体积0.9%Na Cl腹腔注射。试验期间对每只大鼠实行眼压监测:造模前3d、前1d和造模前30min与术后第3d、第7d和第14d用Tono-lab动物眼压计检测眼压,如监测过程中眼压下降,给予二次手术处理以维持高眼压。为避免眼压的生理节律波动,眼压检测时间固定选取上午9:30-10:30之间。将术后眼压稳定维持在1.5倍基线眼压以上的大鼠视作造模成功个体,低于该标准个体将在后续实验中被排除。大鼠在术后第14d眼压测量结束后过量麻醉并断颈处死,死亡后立即解剖分离视网膜组织和玻璃体液。新鲜视网膜组织经超声裂解用于WB检测和RT-q PCR检Tamoxifen生产商测经典焦亡通路相关蛋白水平,玻璃体液离心后用于ELISA检测各型炎症因子释放水平。部分眼球摘取后置于4%PFA中固定,以便于后续制作切片和视网膜平铺片,进行HE染色和IF检测,观察视网膜结构病理改变、视网膜小胶质细胞激活情况和RGCs凋亡情况。【结果】1.MC前房注射术后,大鼠眼压较基础眼压显著升高,术眼眼压在试验期间2周内稳定维持在对侧眼的1.98-2.34倍,差异具有统计学差异(P<0.01);与Ctrl组相比,模型组和治疗组的实验眼眼压亦有明显升高,差异具有统计学显著性(P<0.01)2.对比Ctrl组,COH组实验眼视网膜组织形态结构破坏严重,视网膜全层厚度显著变薄,差异具有统计学显著性(P<0.01)。TMP治疗改善了视网膜组织的结构损伤,并不同程度的增加了视网膜厚度,与COH组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.COH组视网膜内层免疫荧光染色可见Brn3a阳性细胞计数锐减,分布稀疏,差异与Ctrl组相比具有统计学显著性(P<0.01)。80mg/kg的TMP干预一定程度上逆转或减缓了这种趋势,Brn3a阳性细胞较COH组相比有所增加,差异具有统计学显著性(P<0.01)。4.慢性高眼压暴露后,与Ctrl组相比,COH组视网膜中出现明显的Iba-1阳性细胞高表达,差异具有统计学显著性(P<0.01)。TMP治疗组中Iba-1阳性细胞数目较COH组显著减少,此外,TMP治疗还提高了CD68/CD206双阳性细胞的表达水平,与COH组相比,差异具有统计学显著性(P<0.05)。5.与Ctrl组相比,COH组实验眼的玻璃体液中IL-1β和TNF-α浓度增加,而抑炎因子IL-10和TGF-β浓度下降,差异具有统计学显著性(P<0.01)。TMP呈剂量依赖性的逆转了这种趋势,其中高剂量的TMP治疗组与COH组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。6.COH组实验眼的视网膜组织中NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路关键基因和蛋白表达水平上调,较Ctrl组相比,差异有统计学显著性(P<0.01)。低、高剂量的TMP处理组在转录和翻译水平不同程度地下调了它们的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。【结论】1.川芎嗪能够改善慢性高眼压诱导的视网膜损伤,减少RGCs的丢失。2.川芎嗪干预了损伤模式下视网膜小胶质细胞的炎性活化,并诱导视网膜小胶质细胞向M2型极化。3.川芎嗪呈剂量依赖性影响了玻璃体液中细胞因子的释放水平,具体表现为促炎因子浓度下降,而抑炎因子浓度增加。4.慢性高眼压环境带来的视网膜损伤模式下,经典焦亡通路NLRP3/Caspase-1/GSDMD被显著激活,川芎嗪的干预抑制了该通路激活。5.川芎嗪干预小胶质细胞炎性活化参与眼部免疫活动调节,下调NLRP3介导的经典焦亡通路,抑制细胞焦亡,挽救进行性丢失的RGCs,发挥视神经保护作用。