目的:甲状腺未分化癌(Anaplastic thyroid carcinoma,ATC)是甲状腺癌中致死率最高的恶性肿瘤。多柔比星(Doxorubicin,DOX),是甲状腺未分化癌治疗中的唯一获批准的药物,但由于不可逆的组织毒性,使其临床应用受到限制。小檗碱(Berberine,BER)是一种从黄连中提取的异喹啉类生物碱,已被报道在许多癌症中具有抗肿瘤活性。然而,仅有少量文献证明BER对甲状腺癌细胞的抑制作用,BER调节ATC细胞凋亡和自噬的潜在机制尚不清楚。因此,本课题旨在研究BER在ATC细胞CAL-62和BHT-101细胞中的作用及其可能机制。此外,评估BER和DOX联合应用在ATC细胞中的抗肿瘤作用。方法:1.生长增殖:应用CCK-8法检测不同浓度(0-200μM)BER在不同处理时间24 h,48 h,72 h对ATC细胞CAL-62和BHT-101细胞活力的影响;细胞克隆形成实验测定BER对ATC细胞增殖的影响。2.细胞凋亡:用不同浓度BER处理ATC细胞72 h,通过Western blot检测c-caspase3、c-PARP1(两种凋亡相关蛋白)的表达水平,Annexin V-FITC流式细胞术测早期凋亡率和晚期凋亡率。3.细胞自噬:用不同浓度BER处理ATC细胞72 h,Western blot检测LC3B、P62(自噬相关蛋白)的表达水平,GPathologic nystagmusFP-LC3质粒转染进一步验证自噬水平;将BER与晚期自噬抑制剂Bafilomycin A1(Baf A1)合用,Western blot检测LC3B、P62的表达情况;合用早期自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA),通过Western blot和流式细胞术检测BER对自噬和凋亡的影响,从而进一步验证自噬发挥细胞毒性作用/保护作用。4.明确PI3K/AKT/mTOR信号通路是否参与BER对ATC细胞的抑制作用:Western blot检测ATC细胞在用BER处理后PI3K,AKT,mTOR,p-PI3K,p-AKT,p-mTOR蛋白表达情况;通过CCK-8检测在BER分别合用PI3K抑制剂Wortmannin(WOR),AKT抑制剂MK2206,mTOR抑制剂Rapamycin(RA)后对ATC细胞活力的影响。5.BER是否通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控自噬和凋亡发挥对ATC的抑制作用:应用PI3K抑制剂Wortmannin(WOR),AKT激动剂SC79,mTOR抑制剂Rapamycin(RA),通过Western blot和流式细胞术检测在这些工具药的预处理下,BER对ATC细胞凋亡和自噬的影响。6.活性氧ROS是否参与BER诱导的ATC细胞的凋亡和自噬:用活性氧检测探针(DCFH-DA)通过流式细胞仪检测在用BER处理后细胞内ROS水平;应用ROS抑制剂N-acetylcysteine(NAC),通过CCK-8检测细胞活力,Western blot和流式细胞术检测在NAC的作用下,BER对ATC细胞自噬和凋亡的影响。7.BER和DOX联合应用:CCK-8检测不同浓度DOX在48 h,72 h对ATC细胞活力影响及BER和DOX联合应用对ATC细胞活力影响;固定BER和DOX一定浓度比(200:1),通过Compusyn软件计算联合应用指数(CI);选择CI<1时BER和DOX浓度进行合用,通过Western blot和流式细胞术检测两种药物合用对ATC细胞自噬和凋亡的影响。结果:1.BER抑制ATC细胞活力和增殖:用不同浓度BER(0,10,20,40,80,160,200μM)处理24,48和72 h后,发现BER能够很明显抑selleck激酶抑制剂制ATC细胞活力呈时间-剂量依赖性;CAL-62中BER在24,48和72 h的半数抑制浓度(IC_(50))分别为124.60、40.18和30.39μM。同样,在不同浓度BER处理24,48和72 h的BHT-101细胞中BER的IC_(50)值分别为70.29,38.44和22.92μM。此外,细胞克隆数随着BER浓度增加而减少。2.BER诱导ATC细胞凋亡:Western blot结果显示,不同浓度BER诱导凋亡相关蛋白c-caspase3和c-PARP1表达呈剂量依赖性增加(P<0.05);流式细胞术结果表明,在CAL-62细胞中BER(20,40,80μM)作用72 h诱导细胞凋亡率分别为46.32±1.96%,56.17±2.57%,66.27±1.09%(P<0.01),在BHT-101细胞中BER(10,20,40μM)作用72 h诱导细胞凋亡率分别为4.02±0.41%,8.90±0.32%,7.55±0.91%(P<0.01)。3.BER诱导ATC细胞自噬:Western blot结果显示,在ATC细胞中,BER诱导自噬相关蛋白LC3B,P62表达增加;GFP-LC3斑点结果表明,BER诱导自噬体形成;BER合用晚期自噬抑制剂Baf A1后,与单用BER相比自噬相关蛋白LC3B,P62表达进一步增加R428抑制剂(P<0.05);BER合用早期自噬抑制剂3-MA后,与单独BER相比自噬相关蛋白LC3B,凋亡相关蛋白c-PARP1表达均降低(P<0.05),流式细胞术和CCK-8结果也表明与单独BER相比,细胞凋亡率降低而细胞活力升高(P<0.05)。4.BER通过PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导ATC细胞毒性:Western blot结果显示,在ATC细胞中,BER使蛋白p-PI3K/PI3K,p-mTOR/mTOR表达减少,p-AKT/AKT表达增加(P<0.05);CCK-8结果表明在应用PI3K抑制剂Wortmannin(WOR),AKT抑制剂MK2206,mTOR抑制剂Rapamycin(RA)后,与单独BER作用相比,细胞活力进一步降低(P<0.05)。5.BER通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导ATC细胞自噬和凋亡:在合用PI3K抑制剂Wortmannin(WOR),mTOR抑制剂Rapamycin(RA)后,与单独BER相比,自噬相关蛋白LC3B和凋亡相关蛋白c-PARP1表达和凋亡率进一步增加(P<0.05);而应用AKT激动剂SC79后,与单独BER相比,自噬相关蛋白LC3B和凋亡相关蛋白c-PARP1表达和凋亡率反而减少(P<0.05)。6.BER通过ROS聚集诱导ATC细胞自噬和凋亡:DCFH-DA结果表明,在ATC细胞中,BER诱导细胞内ROS水平增加(P<0.01),合用ROS抑制剂NAC后,与单独BER相比,ROS水平增加被逆转(P<0.05);应用ROS抑制剂NAC后,与单独BER相比,自噬相关蛋白LC3B及凋亡相关蛋白c-PARP1表达及凋亡率降低,而细胞活力升高(P<0.05)。7.BER增加ATC细胞对DOX敏感性:CCK-8结果表明,DOX对CAL-62细胞抑制作用呈时间-剂量依赖性。将0.2,0.5,1μM DOX与40μM BER联合应用时发现,与单独应用DOX相比,0.2μM DOX和40μM BER合用时,细胞活力进一步降低;通过联合应用指数CI计算结果显示,采用0.2μM DOX和40μM BER合用,发挥协同作用(CI<1);与对照组相比,单用DOX组,BER组,LC3B,P62蛋白表达增加,与单用DOX组,BER组相比,DOX+BER合用组LC3B,P62蛋白表达进一步增加,细胞凋亡率也进一步升高(P均<0.05)。结论:1.BER抑制ATC细胞增殖,诱导ATC细胞自噬和凋亡。2.BER通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路和上调ROS诱导ATC细胞自噬和凋亡。3.BER通过促进细胞自噬和凋亡增加ATC细胞对DOX的敏感性。