α,β-不饱和倍半萜内酯是一类具有广泛生物活性的天然产物,特别是在抗癌、抗炎、抗氧化及神经保护等方面一直是药物研究的热点,部分化合物被认为具有进一步开发的潜力或者可以作为先导化合物。在本团队的前期研究工作中,已经证明具有α-亚甲基-γ-内酯结构单元的倍半萜类化合物,如小白菊内酯(PA)、土木香内酯(AL)和异土木香内酯(IAL)等,可以通过大鼠的胃肠道代谢或肠道菌体外孵育产生系列特征性的含硫二聚体型代谢物(R-S_n-R或R-S_n-R’,n=1-6)。但是,该类代谢物是否具有生物活性以及其可能的作用机制尚不明确。由于天然药物的体内代谢物有可能是其真正发挥药效的物质基础,同时考虑到上述α,β-不饱和倍半萜内酯的含硫二聚体型代谢物所具有的R-S_n-R骨架结构类型与已知的硫烷类硫化氢(H_2S)供体类似,而且PA、AL和IAL又在近几年相继被证明具有显著的抗结肠癌或结肠炎活性,因此本课题旨在证明天然α,β-不饱和倍半萜内酯相应的含硫二聚体型代谢物作为H_2S供体的可能性,同时阐释其潜在的抗结肠癌活性及机制,为天然α,β-不饱和倍半萜内酯类化合物的成药性研究和H_2S供体新药开发提供依据和新思路。目的:通过对三个具有α-亚甲基-γ-内酯结构单元的倍半萜类化合物PA、AL和IAL及其相关含硫二聚体型代谢物的研究,探讨倍半萜内酯类化合物的含硫二聚体型代谢物作为H_2S供体的潜力,同时探究天然α,β-不饱和倍半萜内酯可能通过H_2S/硫化物途径发挥药理作用的机制,尤其是在肠道癌症及炎症方面。方法:1.采用化学合成及微生物孵育的方法分别制备PA、AL和IAL相应的一硫二聚体、二硫二聚体和三硫二聚体,经常压柱色谱及高压制备液相色谱分离纯化得到单体,并通过高分辨质谱和一维及二维核磁共振波谱技术鉴定所得含硫二Immunization coverage聚体型化合物的结构。2.采用荧光分光光度法绘制上述三个母体化合物的系列含硫二聚体释放H_2S的趋势。通过超高效液相色谱和液质联用技术检测各含硫二聚体与生物活性硫醇—半胱氨酸(CyAZD2281小鼠s)的反应产物,并以PA为例,采用化学衍生化法及液质联用技术捕获并鉴定PA的二硫二聚体和三硫二聚体与Cys的高反应活性中间体,推测其释放H_2S的机理。3.体外细胞和酶活性实验:采用CCK-8法考察上述三个母体化合物及其系列含硫二聚体对两种人结肠癌细胞株HT-29和HCT116的增殖抑制活性,同时采用流式细胞术检测PA及其含硫二聚体对HT-29细胞的促凋亡作用;采用ELISA法考察上述三个母体化合物及其系列含硫二聚体对脂多糖诱导的巨噬细胞RAW 264.7分泌白介素-6和肿瘤坏死因子-α升高的抑制作用。通过酶活性抑制实验考察上述化合物对异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)R132H突变型和野生型,以及脂肪酸合成酶硫酯酶结构域(FASN-TE)的活性抑制作用。4.采用网络药理学的方法检索PA的二硫二聚体和三硫二聚体抗结肠癌的潜在靶点,通过蛋白-蛋白相互作用分析其核心靶点,并通过GO富集分析和KEGG通路分析对其可能机制通路进行探讨。此外,采用分子对接技术预测相关化合物结构与靶点蛋白的理论结合能力。结果:经过大鼠肠道菌体外孵育及化学合成两种途径,分离纯化并鉴定了PA、AL和IAL相应的一硫二聚体、二硫二聚体和三硫二聚体(R-S_n-R,R=PA、AL和IAL,n=1-3)。荧光分光光度法检测结果表明,三个母药的二硫二聚体和三硫二聚体在Cys缺失的条件下均可不同程度地自发释放H_2S,同时随着Cys的加入可以激发其释放H_2S的能力,而一硫二聚体不论Cys存在与否均未检测到H_2S的释放。经液-质联用分析,检测到三个母药的二硫二聚体和三硫二聚体与Cys的反应产物,而一硫二聚体未检测到与Cys的反应产物。以PA为例,成功地捕捉到它的二硫二聚体和三硫二聚体与Cys之间的高反应活性中间体,进而得以推测出相对完整的反应机理。细胞实验表明,PA的二硫二聚体和三硫二聚体对HT-29和HCT116细胞的抑制活性均强于母药。同时,PA及其含硫二聚体(PA-S_n-PA,n=1-3)均对HT-29细胞表现出一定的促凋亡作用。AL和IAL的含硫二聚体对两种结肠癌细胞的增殖抑制活性较低。另外,PA和AL及其相应的二硫二聚体和三硫二聚体均表现出对白介素-6的浓度依赖性抑制作用。体外酶活性抑制实验表明,相比于野生型IDH1,化合物PA-S_3-PA、AL、AL-S_3-AL、IAL对IDH1 R132H突变型表现出选择性抑制活性,IC_(50)分别是0.41±0.02μM、23.00±4.37μM、1.14±0.31μM和6.85±0.45μM。当PA-S_2-PA、PA-S_3-PA、AL-S_2-AL和AL-S_3-AL的浓度为75μM时,对FASN-TE的抑制率在50%左右。通过网络药理学整合PA的二硫二聚体、三硫二聚体以及活性含硫中间体(PA-SH,PA-SSH)结构抗结肠癌的潜在靶点,经拓扑分析得到7个核心靶点(EGFR,HIF1A,ESR1,SRC,ERBB2,CASP3,PIK3CA)。经过分子对接技术预测,上述4种结构形Ceralasertib molecular weight式均可和9种靶点蛋白(EGFR,HIF1A,ESR1,SRC,ERBB2,CASP3,PIK3CA,NFKB,IKBKB)进行结合。同时根据酶活性筛选结果,对IDH R132H突变型与PA-S_3-PA的理论结合能力进行了分子对接计算。结论:本课题从天然α,β-不饱和倍半萜内酯的特征性含硫二聚体型代谢物出发,利用液相色谱和质谱的鉴定优势,并结合细胞和酶活性初步筛选手段以及网络药理学的预测整合能力,证明了具有α-亚甲基-γ-内酯结构单元的倍半萜类化合物的多硫二聚体型代谢物具备释放H_2S的能力,具有成为H_2S缓释供体的潜力。构-效关系分析表明,母体R结构和二聚体中串联在一起的硫原子个数均会对其H_2S释放性能和生物效应产生相应影响。上述结果为H_2S供体研究提供了新思路。同时,本课题也证明了天然α,β-不饱和倍半萜内酯类化合物可能参与肠道内H_2S的调节,并以此为基础发挥药理活性的可能性,从而为α,β-不饱和倍半萜内酯类化合物的成药性研究及含有此类化合物的中草药的药效物质基础和机制研究提供了一个新视角。