第一部分迷迭香提取物干预多重脑震荡大鼠伤后近远期空间认知与情感行为变化研究【目的】新近研究发现,在竞技运动员、战场老兵、家庭虐待者中常常发生多重脑震荡(Multiple cerebral concussion,MCC),其患者多发展成为慢性创伤性脑病(Chronic trauma encephalopathy,CTE),其病理机制不明,临床诊治与预后判断仍然空白。课题组前期实验研究发现迷迭香提取物(Rosemary extract,RE)可有效改善MCC大鼠早期行为学变化。为深入评价RE改善MCC大鼠近期(14天)与远期(10月)空间认知和情感行为变化规律,特设计本项研究。【方法】(1)模型复制:运用金属单摆撞击装置,每间隔24小时打击一次连续3天复制3MCC大鼠模型。(2)动物分组:雄性SD大鼠112只,体重300±10g,随机分为假手术Sham组、3MCC组,RE干预组和吐温(Tween solvent,TW)溶剂对照组。每组再分为14d和10m两个时间点,即14d-Sham、14d-3MCC组、14d-RE组、14d-TW组,与10m-Sham组、10m-3MCC组、10m-RE组、10m-TW组(n=14)。模型复制成功后12h内给予RE干预,14d-RE组伤后连续给药14天,10m-RE组伤后连续给药28天。(3)用Morris水迷宫、十字高架迷宫分别评价大鼠空间学习认知与情感焦虑行为变化。【结果】(1)水迷宫测试结果:I.伤后14d:水下水上平台实验,损伤组大鼠逃避潜伏期下降;无平台实验,损伤组到达原平台的时间延迟、穿过原平台次数减少、Ⅰ象限停留时间延迟;反转平台实验,损伤组逃避潜伏期延迟,各组间比较差异均有统计学意义(Sham VS 3MCC,P<0.05;Sham VS TW,P<0.05);RE干预组除大鼠无平台实验穿过原平台次数外均有改善,比较差异有统计学意义(TW VS RE,P<0.05)。II.伤后10m:水下平台实验,损伤组逃避潜伏期延长,差异均有统计学意义(Sham VS 3MCC,P<0.05;Sham VS TW,P<0.05);RE干预组逃避潜伏期缩短,差异有统计学意义(TW VS RE,P<0.05)。水上平台实验,损伤组逃避潜伏期长,差异有统计学意义(Sham VS 3MCC,P<0.05)。无平台实验,损伤组到达原平台时间延迟、穿过原平台次数与Ⅰ象限停留时间减少,差异均有统计学意义(Sham VS 3MCC,P<0.05;Sham VS TW,P<0.05)。反转平台实验,损伤组逃避潜伏期延长,差异有统计学意义(Sham VS 3MCC,P<0.05;Sham VS TW,P<0.05)。(2)十字高架迷宫(EPM)测试结果:I.伤后14d:总体活动情况,进入开臂次数、开臂停留时间,进入闭臂的次数和向下探究次数5个指标,损伤组均减少,差异均有统计学意义(Sham VS 3MCC,P<0.05;Sham VS TW,P<0.05),RE干预组增加,差异有统计学意义(TW VS RE,P<0.05);闭臂停留时间,损伤组均增加,差异均有统计学意义(Sham VS3MCC,P<0.05;Sham VS TW,P<0.05),RE干预组明显减少,差异有统计学意义(TW VS RE,P<0.05)。II.伤后10m:总体活动情况,进入开臂时间和向下探究次数3个指标,损伤组均减少,差异均有统计学意义(Sham VS 3MCC,P<0.05;Sham VS TW,P<0.05);进入开臂次数,损伤组次数减少,差异均有统计学意义(Sham VS 3MCC,P<0.05;Sham VS TW,P<0.05),RE干预组进入开臂次数增加,差异有统计学意义(TW VS RE,P<0.05);停留闭臂时间,损伤组停留时间增加,差异均有统计学意义(Sham VS 3MCC,P<0.05;Sham VS TW,P<0.05)。进入开臂与闭臂次数的百分比,损伤组开臂百分比减少、闭臂百分比增加,差异有统计学意义(Sham VS TW,P<0.05),RE干预组均有明显改善,差异有统计学意义(TW VS RE,P<0.05)。【结论】(1)多重脑震荡大鼠伤后早期14天与远期10个月,均出现了明显的长时空间记忆与短时工作记忆损害。(2)多重脑震荡大鼠伤后早期14天与远期10个月,均出现了明显的焦虑样行为改变。(3)迷迭香提取物能够明显改善多重脑震荡大鼠伤后早期和远期认知记忆损害及焦虑情感行为。第二部分脑震荡与慢性创伤性脑病大鼠转录组分子标记物研究【目的】多重性脑震荡(Multiple cerebral concussion,MCC)是慢性创伤性脑病(Chronic trauma encephalopathy,CTE)的起始动因,MCC向CTE发展的机制不清,尚缺乏特异性生物标记物作为预后判断依据。为深入探寻MCC向CTE演变所涉及的转录组生物学过程、分子功能、细胞组成及信号通路,通过MCC大鼠额叶皮层的转录组RNA高通量测序,系统筛选生物标记物以辅助MCC/CTE诊断、预后判断和潜在治疗靶点,特设计本项研究。【方法】(1)模型复制:运用金属单摆撞击装置,每间隔24小时打击一次,打击一次复制单次脑震荡(Pure cerebral concussion,PCC)大鼠模型,连续3天复制3MCC大鼠模型。(2)动物分组:雄性SD大鼠54只,体重300±10g,随机分为假手术Sham组、PCC组、3MCC组。每组再分为24h、14d和10m三个时间点,即24h-Sham、24h-PCC组、24h-3MCC组,14d-Sham、14d-PCC组、14d-3MCC组,与10m-Sham组、10m-PCC组、10m-3MCC(n=6)。(3)各组随机抽取3只大鼠取前额叶皮质,采用高通量测序法进行m RNA/Lnc RNA测序,建立m RNA及Lnc RNA原始数据库。(4)根据log FC的绝对值>1且P<0.05作为标准,筛选差异m RNA,再经基因本体论(Gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析。(5)对3MCC组大鼠伤后三个不同时间点纵向、不同打击次数脑震荡大鼠的损伤累积效应横向差异基因进行分析,获得关键差异m RNA。(6)对3MCC m RNA进行时间序列聚类分析,不同聚类进行功能富集分析,并通过STRING数据库建立蛋白互作网络,筛选后所得基因结合前期蛋白组学数据,识别关键m RNA。(7)下载GEO数据库中伤后24h大鼠额叶皮层m RNA,进行差异基因分析,差异基因进行蛋白互作网络分析,获取关键基因,识别关键基因中的趋化因子。(8)通过对三个不同时间点脑震荡大鼠差异基因表达一致性进行筛查,筛选关键Lnc RNA,进行靶基因预测及WGCNA共表达分析。(9)采用Q-PCR验证关键差异m RNA及Lnc RNA。【结果】(1)3MCC组大鼠伤后24h:与假手术组(Sham组)相比,共有142个m RNA上调,16个m RNA下调;通过GO富集分析及KEGG通路分析,发现上调的m RNA主要通过补体和凝血级联途径,参与损伤的反应,免疫及炎症过程的调节;下调的m RNA主要通过非洲锥虫病途径参与细胞对肿瘤坏死因子的反应,血压调节等多种生物学过程。(2)3MCC组大鼠伤后14d:与Sham组相比,共有54个m RNA上调,10个m RNA下调;上调的m RNA主要通过蛋白质消化吸收,PI3K-Akt信号通路和ECM-receptor交互参与损伤反应,免疫,细胞迁移,粘附,炎症等生物学过程;下调的m RNA主要通过钙信号通路和肌动蛋白细胞骨架的调节参与对有机物的反应,蛋白质磷酸化,内源性刺激反应,ERK1和ERK2级联和MAPK级联等生物学过程。(3)3MCC组大鼠伤后10月:与Sham组相比,共有298个m RNA上调,100个m RNA下调;上调的m RNA主要通过心肌细胞的肾上腺素能信号,c AMP信号通路,蛋白质消化吸收,钙信号通路,药物代谢-细胞色素P450和ECM-receptor交互通过参与组织发展,细胞增殖、坏死、凋亡、迁徙等多种生物过程;下调的m RNA主要通过刺激神经组织的中的交互,钙信号通路和c AMP信号通路参与信号传导,神经元分化,细胞增殖,发育的负调控等生物学过程。(4)通过对三个不同时间点多重脑震荡大鼠差异基因表达一致性筛查和不同损伤程度大鼠差异基因累积效应分析,发现Ada、Ano2、RT1-Bb、Calca可能是多重性脑震荡候选的关键差异基因。(5)通过对m RNA进行时间序列聚类分析,筛选后所得基因结合前期蛋白组学数据,发现Gnal是关键m RNA。(6)PCC组大鼠伤后24h:通过差异表达基因构建蛋白互作网络分析,发现IL10,Mmp9,Ccl2,Spp1,Timp1,C3,Cxcl10,Anxa1是PCC伤后24h的关键基因,这些关键基因均在PCC中表达上调,Ccl2、Cxcl10为趋化因子,参与慢性神经炎症。(7)Q-PCR验证Ada、Ano2、RT1-Bb、Calca、Ccl2、Cxcl10结果:(1)Ada:在伤后24h、14d和10m明显上调(P<0.05),其中14d上调最为明显(P<0.01)。(2)Ano2:在伤后24h、14d、10m的3MCC组中明显上调(P<0.05)。(3)RT1-Bb:伤后14d和10m明显上调(P<0.05),其中14d上调最为明显(P<0.01)。(4)Calca:在伤后24h、14d、10m的3MCC组中明显下调(P<0.05)。(5)Ccl2:伤后14d,3MCC组明显上调(P<0.01),与PCC组比,3MCC组明显上调(P<0.05)。(6)Cxcl10:伤后24h,与对照组相比,PCC组和3MCC组均显著上调(P<0.001),与PCC组比,3MCC组明显上调(P<0.05);伤后14d,与对照组相比,PCC组和3MCC组均显著上调(P<0.05)。(8)Lnc RNA(AABR07060620.1):在伤后24h和10m均上调,顺式作用靶基因预测发现m RNA(Pde1c)是AABR07060620.1调控的靶基因,通过WGCNA共表达分析,发现Pde1c为其共表达基因,Q-PCR验证发现Lnc RNA(AABR07060620.1)和Pde1c在伤后24h和14d的3MCC中均上调,P<0.05。【结论】(1)三次脑震荡(MCC)和慢性创伤性脑病(CTE)损伤早期(14天),上调的m RNA主要参与免疫,炎症为主的生物学过程;损伤远期(selleck抑制剂10月),主要参与细胞增殖,坏死,凋亡为主的生物学过程,这些生物学过程是导致MCC向CTE演变和最终结局的病理学基础。(2)识别出MCC/CTE大鼠的新生物标记物Ada、Ano2、RT1-Bb、Calca、Ccl2、Cxcl10和Gnal,它们在MCC向CTE演变过程中可能发挥重要作用。(3)筛选出MCC/CTE大鼠Lnc RNA(AABR07060620.1)通过PdeFebrile urinary tract infection1c下调c AMP途径驱动MCC向CTE的持续演进。第三部分迷迭香提取物改善多重脑震荡大鼠空间认知与情感行为变化机制研究【目的】慢性创伤性脑病(Chronic trauma encephalopathy,CTE)患者尚无特定有效的治疗方法,前期实验提示迷迭香提取物(Rosemary extract,RE)可明显改善多重脑震荡(Multiple cerebral concussion,MCC)大鼠的认知和情感障碍与抗氧化应缴效果,说明RE是CTE潜在的治疗药物,但RE作用机制不明。通过对RE干预MCC大鼠的额叶皮层转录组RNA高通量测序,探究RE干预后差异m RNA所涉及的生物学过程和功能通路,再次验证第二部分结果中生物标记物作为MCC/CTE治疗靶点的可行性,并探讨RE在抗凋亡、抗炎中的作用。【方法】(1)模型复制:运用金属单摆撞击装置,每间隔24小时打击一次连续3天复制3MCC大鼠模型。(2)动物分组:雄性SD大鼠48只,体重300±10g,随机分为假手术sham组、RE干预组和吐温(Tween solvent,TW)溶剂对照组。每组再分为14d和10m两个时间点,即14d-Sham、14d-RE组、14d-TW组,与10m-Sham组、10m-RE组、10m-TW组(n=8)。模型复制成功后12h内给予RE干预,14d-RE组伤后连续给药14天,10m-RE组伤后连续给药28天。(3)每组随机抽取3只到时间点处杀,取大脑前额叶皮质冻存送检。采用高通量测序对前额叶皮质进行m RNA测序,按照log FC的绝对值>1且P<0.05的标准识别差异表达m RNA。(4)对差异m RNA进行GO功能富集分析和KEGG通路分析,结合第二部分的生物标记物筛选,对比RE干预后逆转的m RNA,获得关键差异m RNA,并重点对凋亡与炎症相关的m RNA采用Q-PCR技术验证。【结果】(1)迷迭香提取物干预组大鼠伤后14d与10m差异m RNA变化:(1)伤后14d:与TW组比,共有51个m RNA上调,163个m RNA下调;GO和KEGG分析发现,上调的m RNA主要集中在细胞外区域,参与细胞分化,对外界刺激的反应和多细胞生物过程的调节,主要富集在轴突导向通路,粘附斑激酶通路;下调的m RNA主要集中在细胞质,细胞核和质膜上,参与信号转导的调节,细胞对有机物的反应,细胞表面受体信号通路,对外界刺激的反应,细胞增殖,细胞死亡和凋亡过程等多种生物学过程,主要富集在MAPK信号通路,炎症介质对TRP通道的调节和神经营养素信号通路。(2)伤后10m:与TW组比,共有62个m RNA上调,187个m RNA下调;GO和KEGG分析发现,上调的m RNA主要集中在神经元和突触上,参与神经系统的发育,突触传递信号调节,跨膜运输,氧化应激反应等多种生物学过程,主要富集在钙信号通路上www.selleck.cn/products/Etopophos;下调的m RNA主要集中在细胞外基质,细胞外区域,细胞外囊泡和内质网上,参与细胞分化,粘附,凋亡,死亡等生物学过程,并富集在粘附斑激酶信号通路和PI3K-Akt信号通路。(2)通过RE干预后逆转MCC差异的m RNA分析发现:Ada和Nupr1是RE干预的重要靶点。(3)GO分析筛选凋亡调节相关m RNA:Nupr1和Casp12是RE干预的关键基因,Nupr1、Casp12参与内质网应激,为验证内质网应激通路,将Chop、Bcl2、Bax、Casp3一起作为Q-PCR验证靶标。(1)Nupr1变化:在伤后14d、10m RE组有下调趋势;(2)Chop变化:在14d RE组显著下调(P<0.05)、10m RE组有下调趋势;(3)Casp12变化:在14d RE组显著下调(P<0.05)、10m RE组有下调趋势;(4)Casp3变化:在14d RE组显著下调(P<0.01)、10m RE组有下调趋势;(5)Bcl2变化:在14d RE组显著上调(P<0.05)、10m RE组有上调调趋势;(6)Bax变化:在14d RE组显著下调(P<0.05)、10m RE组有下调趋势。(4)结合第二部分内容,对炎症相关m RNA进行Q-PCR验证。(1)Ada变化:在14d、10m RE组明显下调(P<0.05);(2)Calca变化:在14d RE组明显上调(P<0.05),10m RE组有上调趋势;(3)Ccl2变化:14d RE组中明显下调(P<0.01);(4)Cxcl10变化:14d RE组中明显下调(P<0.01);(5)C3变化:14d RE组中明显下调(P<0.01)。【结论】(1)迷迭香提取物干预多重性脑震荡大鼠的系列差异m RNA参与MCC大鼠脑组织细胞增殖、分化、粘附、死亡和凋亡等多种生物学过程。(2)迷迭香提取物通过两个途径减轻多重性脑震荡大鼠伤后内质网应激反应来减少神经元的凋亡:一是通过下调Casp12和Casp3的表达途径,二是通过Nupr1/Chop途径上调Bcl-2表达与下调Bax表达实现。(3)迷迭香提取物通过下调多重性脑震荡大鼠Ada、Ccl2、Cxcl10和C3表达与上调Calca表达,发挥神经保护作用。