目的:吗啡是目前临床常用的阿片类镇痛药物之一,具有强效镇痛作用。然而在吗啡发挥强大镇痛作用的同时,会产生药物耐受、呼吸抑制、便秘、成瘾等副作用,极大地限制了其临床应用。因此,如何使吗啡在发挥镇痛作用的同时尽可能地减少伴随的副作用,成为人们研究的重点问题。本研究旨在寻找μ阿片受体羧基末端不同关键磷酸化位点与受体下游信号通路之间的关系,通过设计合成覆盖各位点的多肽,竞争性抑制受体磷酸化,以探究多肽干预μ阿片受体磷酸化对受体下游细胞信号通路的影响,从而为增强吗啡镇痛、改善吗啡耐受提供新思路。方法:G_(i/o)诱导的c AMP抑制实验:将HA-MOR质粒与p Glo Sensor TM-22F质粒共转染的HEK-293细胞分为空白组、DAMGO组(10μmol/L)、吗啡组、不同浓度多肽TAT-Seq I、II、Ⅲ、IV、V(5、10、20μmol/L)与吗啡联用组,通过GlAutoimmune disease in pregnancyo Sensor c AMP生物传感器测定各组细胞c AMP含量的变化。β-arrestin2招募实验:将MOR-C端标记Nanoluc的质粒和β-arrestin2-N端标记EYFP的质粒共转染完成的HEK-293细胞分为空白组、DAMGO组(10μmol/L)、吗啡组、多肽TAT-Seq I、II、Ⅲ、IV、V(10μmol/L)与吗啡联用组、Cmpd101(30μmol/L)与吗啡联用组,通过蛋白质相互作用分析法测定各组细胞MOR激动后对β-arrestin2的募集效应。MOR内吞的共聚焦成像实验:将HA-MOR质粒转染完成的HEK-293细胞分为空白组、吗啡(10μmol/L)组,多肽TAT-Seq Ⅲ(10μmol/L)与吗啡(10μmol/L)联用组,Cmpd101(30μmol/L)与吗啡(10μmol/L)联用组。通过细胞免疫荧光法观察各组细胞受体的内吞水平。蛋白免疫印迹法:将HA-MOR质粒转染完成的HEK-293细胞分为空白组、吗啡(10μmol/L)组、多肽TAT-Seq Ⅲ(10μmol/L)与吗啡(10μmol/L)联用组、Cmpd101(30μmol/L)与吗啡(10μmol/L)联用组,通过Western Blot法检测各组细胞MOR的Ser375磷酸化水平。将HA-MOR质粒转染完成的HEK-293细胞分为空白组、吗啡(10μmol/LXH254体外L)组、多肽TAT-Seq I、II、Ⅲ、IV、V(10μmol/L)与吗啡(10μmol/L)联用组、Cmpd101(30μmol/L)与吗啡(10μmol/L)联用组,通过Western Blot法检测各组细胞MOR的ERK1/2磷酸化水平。结果:G_(i/o)诱导的c AMP抑制实验结果显示,单独使用多肽TAT-Seq I、II、Ⅲ、IV、V不会激动MOR下游的c AMP信号通路(P>0.05)。多肽TAT-Seq I与吗啡联用时多组间EC_(50)值比较有统计学意义(F=7.89,P<0.05),其中,不同浓度TAT-Seq I(5、10、20μmol/L)与吗啡联用组的EC_(50)值较吗啡组减少差异有统计学意义(P<0.01)。多肽TAT-Seq II与吗啡联用时多组间EC_(50)值比较有统计学意义(F=3.87,P<0.05),其中,不同浓度TAT-Seq II(10、20μmol/L)与吗啡联用组的EC_(50)值较吗啡组减少差异有统计学意义(P<0.05)。多肽TAT-Seq Ⅲ与吗啡联用时多组间EC_(50)值比较有统计学意义(F=7.77,P<0.05),其中,不同浓度TAT-Seq Ⅲ(5、10、20μmol/L)与吗啡联用组的EC_(50)值较吗啡组减少差异有统计学意义(P<0.01)。多肽TAT-Seq IV与吗啡联用时多组间EC_(50)值比较无统计学意义(F=1.83,P>0.05),其中,TAT-Seq IV(20μmol/L)与吗啡联用组的EC_(50)值较吗啡组减少差异有统计学意义(P<0.05)。多肽TAT-Seq V与吗啡联用时多组间EC_(50)值比较有统计学意义(F=4.83,P<0.05),其中,不同浓度TAT-Seq V(5、10、20μmol/L)与吗啡联用组的EC_(50)值较吗啡组减少差异有统计学意义(P<0.05)。β-arrestin2招募实验结果显示,对比空白组,单独使用多肽TAT-Seq I、II、Ⅲ、IV、V能够不同程度地增加基础BERT值(P<0.05)。多肽TAT-Seq I、II与吗啡联用时E_(max)值比较无统计学意义(F=2.03,P>0.05)。多肽TAT-Seq Ⅲ、Cmpd101与吗啡联用时多组间E_(max)值比较有统计学意义(F=13.14,P<0.05),其中,多肽TAT-Seq Ⅲ、Cmpd101与吗啡联用组的E_(max)值较吗啡组减少差异有统计学意义(P<0.05)。多肽TAT-Seq IV、V与吗啡联用时多组间E_(max)值比较有统计学意义(F=6.34,P<0.05),其中,多肽TAT-Seq V与吗啡联用组的E_(max)值较吗啡组减少差异有统计学意义(P<0.05)。MOR内吞的共聚焦成像实验结果显示,对比吗啡组,多肽TAT-Seq Ⅲ、Cmpd101与吗啡联用组的细胞膜表面M寻找更多OR数量明显增加。蛋白免疫印迹法结果显示,多肽TAT-Seq Ⅲ、Cmpd101与吗啡联用时多组间MOR Ser375磷酸化水平比较有统计学意义(F=59.87,P<0.05),其中,多肽TAT-Seq Ⅲ、Cmpd101与吗啡联用组的MOR Ser375磷酸化水平较吗啡组减少差异有统计学意义(P<0.05)。多肽TAT-Seq I、II、Ⅲ、IV、V和Cmpd101与吗啡联用时多组间MOR ERK1/2磷酸化比较无统计学意义(F=1.20,P>0.05)。结论:μ阿片受体羧基末端磷酸化位点与受体下游信号通路密切相关,不同位点磷酸化在MOR下游G蛋白依赖性信号通路和β-arrestin2依赖性信号通路中发挥不同程度的作用。其中,~(354)TSST~(357)、~(375)STANT~(379)、Thr394位点磷酸化在吗啡介导的MOR下游G蛋白信号通路中起重要作用,~(375)STANT~(379)、Thr~(394)位点磷酸化在吗啡介导的MOR下游β-arrestin2信号通路中起重要作用,~(375)STANT~(379)位点磷酸化与吗啡诱导的MOR内吞密切相关。通过设计多肽与吗啡联用,竞争性抑制关键位点的磷酸化,可以有效增强MOR下游G蛋白依赖性信号通路的激活,在减少β-arrestin2招募的同时减少MOR内吞,为吗啡用药及疼痛的治疗提供新思路。