猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的高度接触性疾病,该病主要引起妊娠中后期母猪流产、断奶仔猪体温升高、呼吸困难等症状,其中断奶仔猪死亡率较高,严重者能够达到100%。自从PRRSV传入我国以来,对养猪业造成了巨大的经济损失。PRRSV感染后能够激活先天性免疫反应,诱导模式识别受体及其下游信号分子的表达,进而引起IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子的大量分泌,甚至可能造成“细胞因子风暴”,引起强烈的间质性肺炎及病毒血症。板蓝根多糖(Radix IsatidiKnee biomechanicss Polysaccharide,IRPS)是板蓝根中含量最多的活性物质,具有抗炎、抗菌、抗病毒、免疫增SARS-CoV抑制剂强及抗氧化等功效。实验室前期研究发现,IRPS在体外能够抑制PRRSV的增殖,同时发现IRPS能够降低PRRSV感染3D4/21/CD163细胞后炎性细胞因子的分泌。目前发现的多糖受体主要有TLR2和TLR4,并且TLR4是分布在细胞膜表面的模式识别受体,能够诱导炎性细胞因子的分泌。因此,我们推测IRPS能够通过TLR4信号通路影响炎性细胞因子的分泌,发挥间接抗病毒的作用。1.IRPS与3D4/21/CD163细胞的结合根据试验需求利用水提醇沉法对IRPS进行提取,并对提取物进行多糖含量以及蛋白含量的测定。利用酪胺还原法对IRPS进行荧光标记,得到标记产物IRPS-FITC。根据MTT法检测其最大安全浓度,发现标记后的最大安全浓度与标记前一致,均为0.0625 mg/m L。将IRPS-FITC与3D4/21/CD163细胞共同作用后发现IRPS能够与3D4/21/CD163细胞结合并且能够与表面的TLR4受体相互作用,为后续试验提供了理论依据。2.IRPS对PRRSV感染3D4/21/CD163细胞的TLR4及其下游信号分子的影响为了探究IRPS对PRRSV感染的3D4/21/CD163细胞TLR4及其下游信号分子的影响,我们采用荧光定量PCR与Western blot试验方法对TLR4、My D88、NF-κB、TRIF、IRF3等信号分子的转录和蛋白表达水平进行检测。结果显示,IRPS能够降低PRRSV感染3D4/21/CD163细胞后TMK-1775供应商LR4转录和蛋白水平升高的现象。对下游My D88、TRIF、TRAF6、NF-κB、IRF3等信号分子的转录和蛋白表达水平检测发现,在6 h和12 h时IRPS能够降低PRRSV感染3D4/21/CD163细胞后My D88、TRIF、TRAF6、NF-κB、P38 MAPK、IRF3等信号分子的蛋白表达水平升高的现象,与TLR4蛋白表达相似。说明在6 h和12 h时,IRPS能够通过抑制TLR4的分泌间接影响My D88依赖型信号通路和TRIF依赖型信号通路的激活,抑制其下游信号分子的表达。3.IRPS在TLR4信号通路被阻断时对PRRSV体外感染炎症细胞因子分泌及病毒增殖的影响试验二中我们对引起细胞因子分泌的TLR4及其下游信号分子的转录和蛋白表达情况进行了检测,发现IRPS能够降低PRRSV感染后TLR4及其下游信号分子的分泌。因此,我们推断IRPS能够通过TLR4信号通路影响PRRSV感染3D4/21/CD163细胞分泌细胞因子,从而间接影响病毒在细胞内的增殖。为了验证以上结果,我们用特异性TAK-242(TLR4抑制剂)对TLR4进行抑制/封闭,用ELISA和荧光定量PCR方法检测,IRPS在TLR4信号通路被阻断时对PRRSV体外感染时炎症细胞因子分泌及病毒增殖的影响。结果显示当TLR4信号通路被阻断时,IRPS对PRRSV感染3D4/21/CD163细胞炎性细胞因子分泌的调节作用被抑制,说明IRPS能够通过TLR4及其下游信号通路影响PRRSV感染3D4/21/CD163细胞炎性细胞因子的分泌;当TLR4信号通路被阻断后,IRPS抑制PRRSV增殖的作用有所降低,但是仍有一定程度的抑制作用;并且当TLR4信号通路被阻断后,病毒对照组的拷贝数与正常的病毒对照组病毒拷贝数之间没有显著的差异,说明TLR4信号通路并不直接影响PRRSV在细胞内的增殖,结合细胞因子分泌情况分析IRPS能够通过TLR4信号通路降低PRRSV感染3D4/21/CD163细胞炎性细胞因子的分泌,增强细胞的稳定性,从而降低PRRSV在细胞内的增殖。