目的:CTLA-4单克隆抗体具有增强抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC),并可借此达到治疗肿瘤的目的。结合CTLA-4与4-1BB在Treg细胞中高表达的优势,以及基于创新性的Ren Lite小鼠技术,研究开发靶向肿瘤微环境Treg细胞的靶向特异性CTLA-4/4-1BB双特异性抗体(CTLA-4/4-1BB Bs Abs),特异性清除肿瘤浸润的Treg细胞,提高抗肿瘤免疫,以期比CTLA-4单抗发挥更好的特异靶向性,提高抗体药物的安全性。方法:通过Ren Lite全人源化共轻链抗体小鼠技术平台,经Ren Lite小鼠体外免疫获得共轻链CTLA-4靶点与4-1BB靶点的抗体序列;利用基因工程技术构建CTLA-4/4-1BB双特异性抗体质粒;采用脂质体介导法瞬时转染蛋白,CHO细胞表达系统表达抗体;使用Protein A亲和层析法纯化抗体,酶标仪测定其浓度,聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)验证蛋白;通过表面等离子共振(SPR)原理检测抗体的亲和力;经低p H稳定性实验与加速稳定selleck性实验检测抗体稳定性;通过酶标仪与流式分析技术检测抗体的体外活性,其中以荧光素酶报告基因法检测抗体的4-1BB激动活性与ADCC功能效应;通过B-h CTLA4/h4-1BB双人源化实验小鼠MC38肿瘤同种移植模型进行体内药效研究;改变抗体亚型,分析抗体亚型不同对作用机制的影响。结果:获得共轻链靶向CTLA-4与4-1BB的抗体质粒,成功构建并表达纯化CTLA-4/4-1BB Bs Abs;所测抗体在低p H稳定性实验(25℃±2℃,p H 3.5±0.1,0 h/6 h分别取样检测)与加速稳定性实验(加速40℃±2℃,60%±5%RH,0 d/7 d分别取样检测)检测中均较为稳定;在报告细胞系4-1BB激动活性检测实验与ADCC效应检测实验中,结果显示CTLA-4/4-1BB Bs Abs具有CTLA-4交联的4-1BB激动活性,以及FcγRIIB交联的4-1BB激动活性,而Urelumab-类似物无交联条件下也具有激动活性,说明CTLA-4/4-1BB Bs Abs具有特异性激动活性;CTLA-4/4-1BB Bs Abs与对照药品Ipilimumab-类似物相比较,具有更强的ADCC活性;体内药效实验结Recurrent infection果显示,CTLA-4/4-1BB Bs Abs比对照药品Ipilimumab-类似物有着更低的起效剂量;在不同亚型抑制肿瘤效果的对比结果中得出,Fc介导的效应功能对于CTLA-4/4-1BB Bs Abs的抑制肿瘤活性起着关键作用。结论:在本研究中,我们设计并构建了基于Ren Lite共轻链小鼠平台的CTLA-4/4-1BB Bs Abs。当CTLA-4和FcγRIIB结合时,CTLA-4/4-1BB Bs Abs表现出4-1BB的模拟活性,也AM-2282采购比对照药品Ipilimumab-类似物表现出更强的ADCC活性。此外,CTLA-4/4-1BB Bs Abs在h CTLA-4/h4-1BB双人源化MC38肿瘤模型中表现出强大的抗肿瘤活性,并依赖于Fc介导的效应功能。综上所述,我们的数据表明,靶向肿瘤微环境中Tregs的CTLA-4/4-1BB Bs Abs可能是一种有前景的人类癌症免疫治疗剂。该研究详细展示了CTLA-4/4-1BB Bs Abs开发的全过程,并探索分析了该抗体不同亚型对药效差异的影响,为靶向肿瘤微环境Treg细胞双特异性抗体的开发以及抗体亚型的选择提供了新的思路。