波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica)是水产品中的优势腐败菌,能够在高盐低温下维持较高的生长速率,导致水产品腐败变质。前期研究表明,外源添加D-色氨酸(D-Trp)可有效抑制高盐环境下致病细菌生长,且可以上调胞内第二信使鸟苷四磷酸(ppGpp),但其抑菌机制尚不清楚。鉴于此,本文以波罗的海希瓦氏菌为研究对象,拟研究ppGpp信号通路介导的D-Trp抑制波罗的海希瓦氏菌的分子机制,为水产品的新型保鲜技术研究提供理论基础和思路。主要的研究结果如下所示:(1)D-Trp对波罗的海希瓦氏菌生长及致腐能力的抑制效果。通过测定在不同Na Cl和D-Trp浓度下细菌的生长情况,发现40 m M D-Trp配合3%Na Cl能够完全抑制波罗的海希瓦氏菌的生长,通过转录组学分析及液质联用发现,DTrp可通过氨基酸代谢影响波罗的海希瓦氏菌的生长。在此基础上,我们通过液质联用发现D-Trp能够有效抑制群体感应信号分子哌嗪二酮(DKPs)(cyclo-(L-phe-L-pro),cyclo-(L-pro-L-Leu),cyclo-(L-Leu-L-Leu)),能够抑制细菌黏附和生物膜的形成,并且降低细菌耐药性。无菌三文鱼块实验结果显示,外源添加40 m M D-Trp可有效降低鱼块的菌落总数并延缓了TVB-N的生成,表明D-Trp降低了波罗的海希瓦氏菌的致腐性。(2)D-Trp对细菌胞内第二信使ppGpp的调控机制。通过转录组学发现DTrp处理下ppGpp合成结构域显著上调,Spo T分解基因显著下调,经过高效液相色谱(HPLC)分析发现胞内第二信使ppGpp在D-Trp处理后显著上调。分子对接表明D-Trp与ppGpp合成蛋白Rel A和分解蛋白Spo T的活性位点存在范德华力、pi-pi键、传统氢键等相互作用,进而影响蛋白的生理功能。通过分子动力学分析www.selleck.cn/products/gdc-0068发现,D-Trp能够对Rel A和Spo T松散的蛋白结构进行挤压和拉伸。荧光定量PCR实验验证了D-Trp对波罗的海希瓦氏菌合成ppGpp基因的调控情况。通过构建Rel A,Spo T敲除株以及双敲除株,我们发现D-Trp的抑菌性降低,体现为ppGpp敲除株在D-Trp的抑制条件下恢复生长,进一步明确D-Trp可通过上调细菌胞内ppGpp含量抑制细菌生长。(3)ppGpp介导的波罗的海希瓦氏菌致腐机制研究。野生株(WT)和敲除株(ΔRel A,ΔSpo T,ΔRΔS)反接种到三文鱼无菌鱼块中,典型腐败指标(p H、菌落总数、TVB-N、胞外蛋白酶活性)结果表明,腐败中后期,ppGpp缺失株ΔRel A和ΔRΔS的菌落总数,TVB-N含量及胞外蛋白酶活性都显著低于野生株及敲除株ΔSpo T,泳动性结果表明ppGpp缺失菌株的泳动能力显著下降,同时细菌的黏附能力测定、生物膜形成能力测定表明了ppGpp敲除后,细菌的黏附能力和菌膜形成能力显著提升,共聚焦结果显示双敲除株生CP-690550物被膜较厚且结构较为完整。通过刚果红法和苯酚-浓硫酸法测定胞外多糖含量,结果表明ppGpp双敲除株ΔRΔS胞外多糖产量显著高于野生株及单敲除株。通过转录组学分析及荧光定量PCR验证发现ppGpp缺失影响了鞭毛运动基因、三甲胺合成基因、蛋白酶活性基因、脂代谢基因、胞外多糖调控基因、生物膜调控基因及氨基酸代谢基因。以上研究找到了一种水产品特定腐败菌的新型抑制Symbiont-harboring trypanosomatids剂,揭示了D-Trp对波罗的海希瓦氏菌生长及致腐能力的调控机制,明确基于胞内第二信使ppGpp的D-Trp抑菌机理,对水产品的防腐保鲜提供一定的理论基础和现实意义。