研究背景新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)导致的新型冠状病毒疾病(coronavirusdisease2019,COVID-19)和感染疫情是全球重大公共卫生问题。随着时间推移,SARS-CoV-2演化出了多种变异株,世界卫生组织将Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron变异株划分为“受关注的变异株(variant of concern,VOC)”,这些变异株在病毒刺突蛋白具有多个关键突变,导致病毒致病力、传播性改变,疫苗保护率降低,并且取代原来的流行株,引起新一轮的大流行,成为疫情防控的新问题。目前基因测序和系统发育分析是鉴别SARS-CoV-2变异株的金标准方法,但是基因测序方法复杂、繁琐且耗时,需要专业设备和专业人员,在资源有限的地区应用受到限制。因此迫切需要一种快速监测突变株的检测方法,可以连续监测SARS-CoV-2变异株流行并动态调整疾病控制措施,以应对不断变化的变异株流行对疾病治疗、疫情防控措施和疫苗有效性的影响。研究目的和意义成簇规律间隔短回文序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与 CRISPR 相关的效应蛋白(CRISPR-associated,Cas)构成的CRISPR-Cas系统,被认为是新一代分子诊断技术,因此备受关注。本课题的研究目的为整合重组酶介导的等温扩增反应(recombinase aided amplification,RAA)与CRISPR-Cas12a技术,开发并建立RAA/CRISPR-Cas12a检测平台,实现在一个反应管内检测单碱基突变;同时,通过设计并筛选得到多个SARS-CoV-2 变异株特异性的引导 RNA(CRISPR RNA,crRNA),基于 RAA/CRISPR-Cas12a检测平台实现对目前SARS-CoV-2主要VOCs的快速检测与鉴别。新型RAA/CRISPR-Cas12a检测平台为SARS-CoV-2变异株的检测与鉴别诊断提供了新的方法和解决方案。该技术平台也可广泛用于其它病原体检测、耐药基因筛查以及遗传病、肿瘤基因的诊断,具有很好的应用前景。研究方法1.RAA/CRSPR-Cas12a检测平台的建立:首先表达和纯化了具有核酸酶活性的AsCas12a和LbCas12a蛋白;随后通过RAA引物设计在检测靶标位点上游序列人为引入原型间隔序列相邻基序(protospacer adjacent motif,PAM),确保可以检测不含有PAM基序的任何目标序列;此外,在PAM基序近端引入单个非匹配碱基突变,筛选合适的次优PAM(suboptimal PAM),以提高CRISPR-Cas12a反应的特异性,实现对单碱基突变位点的快速、特异性检测和分型;在此基础上,建立了单管Dibutyryl-cAMP化学结构一步法(one pot)RAA/CRSPR-Cas12a检测平台,实现RAA扩增反应和CRISPR-Cas12a酶切检测在同一密闭体系内完成,简化了操作步骤,避免了扩增产物转移造成的核酸污染。2.RAA/CRSPR-Cas12a检测SARS-CoV-2变异株方法的建立:基于SARS-CoV-2变异株刺突蛋白的特征性突变位点设计并获得了 5个等位基因特异性crRNAs,分别为 crRNA-417N、crRNA-478K、crRNA-484K、crRNA-501N 以及crRNA-614D,以及 2 个 Omicron 特异性 crRNAs,crRNA-S-49X 和 crRNA-50X,可用于检测和区分SARSNSC 119875-CoV-2的主要VOCs,包括Alpha、Beta、Delta和Omicron变异株及其子谱系BA.1和BA.2。3.RAA/CRSPR-Cas12a检测SARS-CoV-2变异株方法的评价:首先以梯度稀释的DNA质粒样本作为模板评价RAA/CRSPR-Cas12a检测SARS-CoV-2变异株方法的最低检测下限(limit of detection,LOD)。然后通过检测感染人常见呼吸道病毒且SARS-CoV-2阴性的临床核酸样本,评价RAA/CRSPR-Cas12a检测SARS-CoV-2变异株方法的特异性。最后通过检测COVID-19患者的SARS-CoV-2阳性核酸临床样本,其中包括4例野生株(Wuhan-Hu-1)、16例Aplha变异株、14例Beta变异株、15例Delta变异株以及5例Omicron变异株,比较RAA/CRSPR-Cas12a与Sanger测序法对SARS-CoV-2变异株检测和分型结果的一致性。研究结果1.成功构建了 RAA/CRISPR-Cas12a检测平台,整个反应可以在39℃同一反应管中进行,结果可以用荧光读出仪器读出或者在便携式animal component-free medium蓝光仪下用肉眼直接读出。2.基于RAA/CRISPR-Cas12a检测平台设计了 5个等位基因特异性crRNAs,可以特异性识别并区分特征突变位点,即K417N、T478K、E484K、N501Y和D614G,检测方法的LOD为104拷贝/μL;针对54份SARS-CoV-2阳性临床核酸样本进行分型,与Sanger测序结果的一致性为92.59%(50/54),各crRNAs检测相应突变位点的灵敏度为88.2%～100.0%,特异度为97.5%～100.0%。3.基于RAA/CRISPR-Cas12a检测平台设计了 2个Omicron变异株特异性crRNAs,可以正确区分Omicron变异株及其子谱系BA.1,其中crRNA-S-49X可特异性检测BA.1及其子谱系,检测方法的LOD为10拷贝/μL;crRNA-S-50X可特异性检测Omicron变异株包括其所有亚型,LOD为100拷贝/μL。应用2个Omicron特异性crRNAs检测54份SARS-CoV-2阳性临床核酸样本,5例感染Omicron BA.1和BA.2子谱系的样本检测均阳性,其余49例非Omicron变异株感染的样本检测均阴性。4.检测感染11种常见呼吸道病原体的SARS-CoV-2阴性临床核酸样本时,所有crRNA均未观察到非特异性交叉反应。研究结论本课题成功建立了 RAA/CRISPR-Cas12a快速检测平台,可特异性区分SARS-CoV-2的多种主要受关注的变异株,包括Alpha、Beta、Delta和Omicron变异株及其子谱系BA.1。跟病毒基因测序比较,该方法简单、快速,可在资源有限的环境中常规实施,为SARS-CoV-2及其变异株的检测与鉴别诊断提供了新的方法和解决方案。