非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种高度接触性传染病,对全球养猪业造成重创。猪只感染强毒株引起高死亡率,至今尚无安全有效的疫苗可用于防控。非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是大分子DNA病毒,基因组结构复杂且多变,随着ASFV在国内的流行,病毒基因组不断出现变异,变异弱毒株逐渐成为流行毒株,其潜伏期长、隐蔽性强,给ASF的早期诊断带来巨大挑战,因此亟需研制出高效、灵敏、特异的检测技术,并研发安全有效的疫苗。TGF-beta/Smad抑制剂本研究通过CHO悬浮细胞系统表达了 ASFV pK205R、p17及p12蛋白,并分析以上蛋白作为诊断抗原的抗原性;通过开发稳定表达ASFV pK205R重组蛋白的CHO细胞株,实现抗原蛋白的大规模生产,并以其作为抗原蛋白,建立以ASFV pK205R蛋白为靶标的间接ELISA方法;利用纯化的pK205R蛋白作为免疫原,制备抗pK205R蛋白的单克隆抗体,并对其抗原结合表位进行鉴定。另一方biobased composite面,通过反向遗传操作技术拯救出能表达ASFV pK205R蛋白的重组PRRSV弱毒疫苗株,并对免疫抗体水平进行评估。主要研究内容如下:为了验证ASFV pK205R、p17及p12蛋白作为诊断抗原的潜力,根据我国流行毒株 ASFV SY18(GenBank ID:MH766894.1)已公布的K205R、D117L及 061R基因序列,利用同源重组的方法分别将基因连接到pCDNA3.1载体上,构建真核表达质粒 pCDNA3.1-pK205R-strep、pCDNA3.1-p17-strep 和 pCDNA3.1-p12-strep。将真核表达质粒转染至CHO细胞,通过strep标签纯化pK205R、p17及p12重组蛋白,以纯化蛋白作为抗原免疫BALB/C小鼠,制备了相应的多克隆抗体,通过Western blotting及IFA验证了多克隆抗体具有良好的特异性。为了获得可稳定高效表达ASFV pK205R蛋白的CHO细胞株,实现优势抗原蛋白的大规模生产,将融合Twin strep标签的K205R基因片段同源重组至pCDNA3.4载体上,通过G418加压筛选结合有限稀释法的方法构建了可分泌表达ASFV pK205R蛋白的稳转细胞株CHO-pK205R。通过RT-PCR的方法从连续传代20代的细胞样品中扩增出K205R基因,表明该基因成功整合到细胞基因组中;通过CCK-8及细胞计数的方法验证了重组蛋白表达细胞系具有良好的细胞活性;通过Twin strep标签对重组pK205R进行纯化并定量,结果显示蛋白纯化量可达0.3～0.43mg/mL。将纯化的pK205R蛋白免疫BALB/C小鼠,取免疫4次的小鼠脾细胞与SP2/0杂交瘤细胞进行融合,通过3次亚克隆获得了 2株抗ASFV pK205R蛋白的单克隆,经IFA和Western blotting鉴定,获得的单克隆抗体特异性良好。取其中抗体分泌更稳定、效价更高的2H11单克隆抗体进行亚型鉴定及其识别的B细胞表位鉴定,结果显示2H11单克隆抗体重链为IgG1,轻链为Kappa链,其识别的最小表位序列为2 VEPREQFFQDLLSAV16,通过生物信https://www.selleck.cn/products/Staurosporine.html息学分析,该表位在不同分型毒株中高度保守。为了建立一种灵敏的、可早期诊断ASFV的ELISA检测方法,通过构建的稳转悬浮细胞系CHO-K205R纯化pK205R重组蛋白,将其作为抗原包被酶标板,并对各反应条件进行优化,建立了既可检测野毒感染又可监测表达ASFV pK205R蛋白的重组PRRSV活载体病毒体内抗体水平的间接ELISA方法。对建立的间接ELISA检测方法进行评估,证明该方法特异性强,灵敏度高,稳定性好,与试剂盒符合率高达98.1%。pK205R蛋白抗原免疫性较强,具有开发疫苗的潜力。本研究利用反向遗传操作技术将K205R基因插入到由PRRSV强毒株vHuN4传代致弱的疫苗株vHuN4F112(GenBank ID:EF635006)基因组的ORF1b和ORF2之间,获得了重组K205R基因的PRRSV全长感染性克隆,经过体外转录和病毒拯救获得重组病毒vA-ASFV-K205R株,其生长特性与亲本毒株相似,且外源基因在体外传代具有稳定性。将该重组病毒免疫PRRSV和ASFV抗原和抗体均为阴性的仔猪,通过PRRSV抗体试剂盒及本研究建立的pK205R间接ELISA检测方法监测抗体水平,结果证明该基因工程活载体疫苗候选毒株可诱导产生针对ASFV pK205R的特异性抗体。