目的:椎间盘退变主要以“腰背痛”为特征,祖国医学中属“痹症”,肾虚血瘀是其主要病机。炎症因子浸润作为氧化应激的驱动因素,可诱导细胞内能量代谢失衡、线粒体ICI 46474试剂功能损伤,进而引起髓核细胞凋亡与细胞外基质降解,最终导致椎间盘退变。基于“补肾活血”治则,补肾活血方治疗椎间盘退变临床收效良好,但具体作用机制尚不详尽。通过体外实验验证炎症因子通过诱导髓核细胞凋亡导致椎间盘退变的发病机制,探讨补肾活血方基于AMPK/SIRT1信号通路抑制椎间盘退变的作用机制是本研究的主要目的。方法:收集临床患者髓核组织,对其进行分离、提取、培养。采用TNF-α干预髓核细胞,观察补肾活血方对髓核细胞的保护作用。(1)CCK-8法检测补肾活血方和TNF-α对髓核细胞增殖的影响;(2)实时荧光定量PCR检测MMP-3、MMP-9、ADAMTS-4、ADAMTS-5的基因表达水平;(3)免疫荧光染色检测Collagen II、MMP-3表达水平;(4)Western Blot检测Collagen II、Aggrecan、ADAMTS-4、MMP-3、Cleaved-caspase3、mito-cyt、cyto-cyt、的蛋白表达水平;(5)TUNEL检测髓核细胞在TNF-α和补肾活血方干预下凋亡情况;(6)透射电镜观察线粒体形态和凋亡小体;(7)流式细胞技术检测髓核细胞在TNF-α和补肾活血方干预下凋亡情况;(8)活性氧和线粒体荧光探针检测髓核细胞内ROS含量和线粒体定位;(9)Cu Zn/Mn-SOD法检测髓核细胞在TNF-α和补肾活血方干预下SOD活性情况;(10)ATP化学发光法检测髓核细胞在TNF-α和补肾活血方干预下ATP代谢情况;(11)WB检测补肾活血方对TNF-α刺激下的髓核细胞在AMPK/SIRT-1信号通路的AMPK磷酸化表达情况。结果:1.采用CCK-8法检测髓核细胞在补肾活血方含药血清和TNF-α干预下的细胞增殖情况,发现:(1)不同浓度的补肾活血方含药血清干预髓核细胞24h,与空白血清组相比,5%、10%、15%以及20%补肾活血方含药血清组的细胞增殖率均升高(P<0.01),其中15%补肾活血方含药血清为最佳浓度(P<0selleck Wnt-C59.01);(2)不同浓度的空白血清干预24h,与空白组相比,5%、10%、15%以及20%空白血清组的细胞活力均升高(P<0.05),不同浓度空白血清组相比,其增值率无明显差异(P>0.05);(3)使用TNF-α干预髓核细胞24 h后,不同浓度补肾活血方含药血清再干预24 h,与空白对照组相比,模型组(TNF-α干预)增值率降低(P<0.01);与模型组(TNF-α干预)相比,5%、10%、15%补肾活血方含药血清组的增值率均升高(P<0.01)。2.实时荧光定量PCR检测发现,与空白组相比,模型组ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-9基因表达水平显著升高(P<0.01);与模型组相比,15%补肾活血方组ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-9基因表达水平显著降低(P<0.01)。3.免疫荧光检测发现,与空白组相比,模型组Collagen II表达水平降低(P<0.01),MMP3表达水平Cryogel bioreactor升高(P<0.01);与模型组相比,15%补肾活血方组Collagen II表达水平升高(P<0.01),MMP3表达水平降低(P<0.01)。4.Western Blot检测发现,与空白组相比,模型组Collagen II、Aggrecan、mito-cyt蛋白表达水平降低(P<0.01),ADAMTS-4、MMP3、cyto-cyt、c-caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.01);与模型组相比,15%补肾活血方组Collagen II、Aggrecan、mito-cyt蛋白表达水平升高(P<0.01),ADAMTS-4、MMP3、cyto-cyt、c-caspase-3蛋白表达水平降低(P<0.01)。5.TUNEL检测髓核细胞凋亡情况发现,与空白组相比,模型组髓核细胞凋亡数量增多(P<0.01);与模型组相比,15%补肾活血方组髓核细胞凋亡数量降低(P<0.01)。6.透射电镜观察线粒体形态和凋亡小体发现,与空白组相比,模型组线粒体发生肿胀;凋亡小体数量增多;与模型组相比,15%补肾活血方组线粒体形态部分恢复正常,凋亡小体数量减少。7.流式细胞仪检测髓核细胞凋亡发现,与空白组相比,模型组髓核细胞凋亡率升高(P<0.01);与模型组相比,15%补肾活血方组髓核细胞凋亡率降低(P<0.01)。8.活性氧和线粒体荧光探针检测细胞内活性氧水平和线粒体定位发现,与空白组相比,模型组活性氧含量升高(P<0.01),线粒体分裂的数量升高;与模型组相比,15%补肾活血方组活性氧含量降低(P<0.01),线粒体分裂的数量降低(P<0.01)。9.Cu Zn/Mn-SOD法检测髓核细胞内SOD活性发现,与空白组相比,模型组SOD含量降低(P<0.01),其活性降低;与模型组相比,15%补肾活血方组SOD含量升高(P<0.01),其活性升高。10.ATP化学发光法检测髓核细胞内ATP代谢发现,与空白组相比,模型组ATP含量降低(P<0.01);与模型组相比,15%补肾活血方组ATP含量升高(P<0.01)。11.Western Blot检测补肾活血方对TNF-α刺激下髓核细胞中AMPK磷酸化表达情况发现,与空白组相比,模型组AMPK无明显差异(P>0.05),p-AMPK蛋白表达水平升高(P<0.01);与模型组相比,15%补肾活血方组AMPK无明显差异(P>0.05),p-AMPK蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与15%补肾活血方组相比,AMPK抑制剂组AMPK无明显差异(P>0.05),p-AMPK蛋白表达水平降低(P<0.01);与SIRT-1阴性对照组相比,SIRT-1敲除组SIRT-1蛋白表达水平降低(P<0.01),15%补肾活血方组SIRT-1蛋白表达水平升高(P<0.01);与15%补肾活血方组相比,SIRT-1敲除组SIRT1蛋白表达水平降低(P<0.01),AMPK抑制剂组SIRT-1蛋白表达水平降低(P<0.01)。与空白组相比,模型组SIRT-1蛋白表达水平升高(P<0.01);与模型组相比,15%补肾活血方组SIRT-1蛋白表达明显升高(P<0.01);与15%补肾活血方组相比,AMPK抑制剂组SIRT-1蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:本研究揭示了在“补肾活血”治则理论指导下,补肾活血方治疗椎间盘退变的作用机制,为补肾活血方治疗“肾虚血瘀”型椎间盘退变的辨证论治提供了分子生物学的研究基础。在体外细胞实验中发现补肾活血方含药血清可抑制炎症因子介导的氧化损伤,达到治疗ROS堆积导致的椎间盘微环境的“瘀”,可通过AMPK/SIRT1信号通路调控能量代谢,促使线粒体功能恢复,产生稳定的ATP,为细胞正常功能提供能量,进而抑制髓核细胞凋亡,延缓椎间盘退变。