侵袭性念珠菌病是一种威胁生命的真菌感染。热带念珠菌是一种主要的非白色念珠菌,可引起侵袭性念珠菌病。由于抗真菌药物较少,以及对抗真菌药物产生耐药性的耐药菌株的迅速出现,迫切需要开发具有新型作用机制的抗真菌药物。抗菌肽(AMPs)具有低耐药倾向、广谱活性、低细胞毒性等优点,是用来对抗多药耐药病原体和治疗侵袭性念珠菌感染性疾病的潜在药物。但与抗生素相比,抗菌肽的抗菌活性较低成为了限制其开发的重要因素之一。基于作用靶点的结构改造和提高跨膜转运效率是提高抗菌肽活性的两种重要途径。CGA-N12(ALQGAKERAHQQ)和CGA-N9(RILSILRHQ)是实验室发现的两个非破膜特异性抗念珠菌肽,为提高抗菌肽CGA-N12和CGA-N9的抗念珠菌活性,本文开展了以下研究:(1)基于靶点β-1,6-葡聚糖合成酶Ct KRE9蛋白的CGA-N12结构改造。基于Ct KRE9结构,利用分子对接技术,合理设计了一系列CGA-N12结构类似物。对制备得到的抗菌肽CGA-N12及其结构类似物进行抗菌活性、IACS-10759供应商溶血活性、稳定性测定,embryonic culture media得到6个抗菌活性提高、细胞毒性小、稳定性好的类似物,对热带念珠菌具有高效抗菌活性;与氟康唑相比,对顽固型热带念珠菌的生长表现出更强的抑制作用;其中,CGA-N12-0801为最佳结构类似物,其最小抑菌浓度为3.46μg/m L,比CGA-N12的抗菌活性提高29.09倍。之后,探究了CGA-N12结构类似物的作用机制,采用分子对接技术探究其与Ct KRE9蛋白之间的分子相互作用,通过酶活测定分析其对Ct KRE9蛋白酶活性的抑制作用,使用结晶紫染色法和96孔微量滴定板法测定其对热带念珠菌生物膜的作用,利用扫描电镜和透射电镜观察其对热带念珠菌细胞壁、细胞膜等的作用。结果表明,降低CGA-N12与Ct KRE9的对接能量,增加CGA-N12的正电荷数,可以显著提高抗菌肽对热带念珠菌的抗菌活性;CGA-N12结构类似物具有抑制生物膜形成和消除已形成生物膜的能力,与氟康唑相比,它们表现出更强的消除已形成生物膜的selleck NMR能力;电镜观察和Ct KRE9蛋白酶活性抑制试验结果表明,CGA-N12及其结构类似物通过破坏细胞壁的合成和细胞膜的完整性来杀灭热带念珠菌。(2)CGA-N12和CGA-N9跨膜转运蛋白的挖掘。获得经CGA-N12处理不同时间的热带念珠菌的转录组;分析m RNA表达模式,发现热带念珠菌寡肽转运蛋白基因Ct OPT1、Ct OPT2、Ct OPT9和Ct OPT12表达模式与抗菌肽CGA-N12的跨膜量呈正相关,推测Ct OPT1、Ct OPT2、Ct OPT9和Ct OPT12蛋白协助CGA-N12跨膜转运。采用RT-PCR技术,从热带念珠菌中克隆了12条OPT基因的编码序列(CtOPTs)。分子对接结果表明,Ct OPT1、Ct OPT9和Ct OPT12蛋白有助于CGA-N9的跨膜转运,且Ct OPT1和Ct OPT12协助CGA-N9跨膜转运能力更强。综上所述,基于靶点蛋白的计算机辅助药物设计技术合理设计抗菌肽是一种简单可靠的方法,可加速新型抗菌肽的开发,并为侵袭性念珠菌感染疾病提供了理想的候选药物。同时,挖掘跨膜转运蛋白以及探究其协助抗菌肽跨膜的机制,对提高抗菌肽的跨膜转运效率,进而提高非破膜抗菌肽的抗菌活性非常重要。