细胞核作为真核细胞的调控中selleck HPLC心,在细胞生长、分化、代谢等过程中发挥着不可替代的重要作用。而细胞核功能紊乱会导致细胞凋亡、坏死并诱导各种疾病的发生。因此,设计核靶向荧光探针实现细胞核状态的精准可视化对生命科学研究具有重要意义。当前核靶向探针设计通常以吡啶盐、喹啉盐、苯并噻唑盐等阳离子基团作为关键构件,通过它们与DNA磷酸根基团的静电作用实现与DNA的有效结合。然而,归因于线粒体内膜的高负电位,嫁接阳离子基团也同样是构建线粒体靶向探针的重要策略。因此在核靶向探针设计领域的一个关键科学问题是:如何基于阳离子基团通过化学结构修饰实现从线粒体靶向到核靶向的切换。解决上述问题对研发高度专一的核靶向探针至关重要。粘度是细胞中重要的微环境参数之一,它影响着细胞内生物分子间的运输、扩散、信号传递等多种过程。粘度正常是细胞核功能执行的前提条件,而核粘度异常时会影响基因的完整性与表达,进而导致细胞功能紊乱以及炎症等疾病。因此研发核粘度荧光探针对探究其病理和生理功能具有重要意义。过氧化氢(H_2O_2)是一种最稳定的活性氧。它作为一把“双刃剑”,低浓度H_2O_2在调控细胞生长、增殖和分化等生理过程中扮演重要的角色,而高浓度的H_2O_2会导致氧化应激并诱发癌症等相关疾病的发生。线粒体作为真核细胞的重要细胞器GDC-0973溶解度,其功能的执行依赖于氧化还原稳态的控制。因此,设计荧光探针监测线粒体内H_2O_2浓度的变化对探究H_2O_2的病理和生理功能具有重要意义。在H_2O_2荧光探针设计中,硼酸酯是最广泛使用的响应基团。它经历H_2O_2的亲核进攻、Bayer-Villiger类氧化重排和水解最终释放自由羟基。然而过氧亚硝基负离子(ONOO~-)经历同样的机制与硼酸酯发生反应,并且其反应速率比H_2O_2快5个数量级。因此“如何基于硼酸酯结构设计高选择性H_2O_2的荧光探针”仍是值得研究的科学问题。本论文围绕着上述两个关键的科学问题开展了以下三章的研究工作:(1)羟基苯乙烯吡啶盐(HSP)是一种具有推拉电子结构和分子内电荷转移的双光子荧光团,同时它基于吡啶盐阳离子基团具有良好的线粒体靶向能力。据此我们以HSP为例,设计了其羟基、甲氧基、氟原子取代的衍生物,包括:DHSP、MHSP、DMSP和FHSP(图1),试图通过简单的化学结构修饰实现HSP从线粒体靶向到核靶向的转换。发现:在HSP结构中仅引入一个额外的邻位羟基即可实现该分子从线粒体靶向到核靶向的转换。通过时间依赖荧光共定位实验证实:具有邻羟基结构的DHSP具有优异的核靶向能力,仅仅5分钟内就能实现有效的细胞核定位。通过荧光滴定实验测定其与DNA的结合常数为1.92×10~6M~(-1)。该结合常数与常规核染料DAPI的结合常数(10~6 M~(-1))相当,表明DHSP与DNA具有较强的结合力。分子对接计算证实:DHSP通过其吡啶盐阳离子基团与DNA的磷酸根阴离子基团之间的静电作用以及其邻位羟基与DNA的胞嘧啶和腺嘌呤之间的氢键作用实现与DNA的有效结合。利用圆二色谱实验证实:DHSP与DNA为小沟槽结合模式。该探针成功应用于可视化细胞周期与细胞凋亡过程中细胞核pain medicine特征的形态变化,以及活体成像小鼠脑缺血再灌注损伤过程中细胞核明显固缩与核深染等。(2)上章研发的核靶向探针DHSP具有推拉的π共轭体系(甲基吡啶盐作为电子受体和邻二羟基苯作为电子给体)和扭曲的分子内电荷转移特征。基于粘度可阻滞推拉结构单元围绕着单键的旋转,我们推断该探针应是点亮型核粘度探针(图2)。荧光光谱实验证实该探针在540 nm处对粘度呈现点亮型响应。此外,该探针被成功应用于可视化制霉菌素、脂多糖、饥饿和过氧化氢(H_2O_2)诱导的核粘度提高,以及重金属过度摄入诱导的核粘度降低。(3)我们桥连香豆素与苯并吡喃氧鎓盐骨架构建近红外荧光团BC-OH,并利用苯硼酸频哪醇酯屏蔽酚羟基设计了线粒体靶向的H_2O_2荧光探针BCB(图3)。该探针凭借骨架中多个不同活性的亲电位点(位点1-3)实现高选择性监测H_2O_2,不受ONOO~-、H_2S和SO_2的干扰。H_2O_2亲核进攻硼酸酯(位点1)后释放BC-OH,在670 nm处呈现点亮型的荧光响应。而ONOO~-亲核进攻亲电活性较高的苯并吡喃氧鎓盐(位点2),进而氧化断裂碳碳键,产生HCA,其发射波长为457 nm。此外,硫化氢(H_2S)及二氧化硫(SO_2)亲核进攻探针的亲电位点3,分别生成加合物BCB-SH和BCB-SO_2(发射波长573 nm)。该探针被应用于可视化细胞线粒体内的H_2O_2的内源性和外源性产生、帕金森症细胞模型中H_2O_2水平的提高以及活体成像斑马鱼中的H_2O_2。