【目的】改良双乳化溶剂挥发法制备多孔PLGA纳米微泡(PLGA nanobubbles,PLGA NBs),通过表征和超声成像验证多孔PLGA NBs的最佳制备方案,适配体(aptamer H,Apt H)和尿激酶(urokinase,UK)搭载于多孔PLGA NBs制备靶向载药纳米微泡(Apt H@PLGA@UK NBs),用于急性深静脉血栓(deep venous thrombosis,DVT)的治疗,探索一种安全、有效、毒副作用低的治疗方式,为急性DVT的诊疗开辟新思路。【方法】1.根据不同致孔剂方案分为Control组,单致孔剂组,双致孔剂组;不同致孔剂浓度分为2%NH_4HCO_3组,4%NH_4HCO_3组,6%NH_4HCO_3组,8%NH_4HCO_3组,10%NH_4HCO_3组。制备各组多孔PLGA NBs,分别通过光学显微镜、电子显微镜、Zeta电位和粒径分布及稳定性进行检测。2.运用自制的体外超声成像装备对各组PLGA NBs进行超声成像检测,并比较各组PLGA NBs的超声造影峰值强度(Peak Intensity,PI),从而确定最佳的致孔剂方案和致孔剂浓度,确定PLGA NBs的最佳显影浓度。3.分别制备载药微泡(PLGA@UK NBs)和靶向载药微泡(Apt H@PLGA@UK NBs),检测UK的包封率和载药量,Apt H的结合率。采用人脐静脉内皮细胞毒性实验和实验兔体内毒性实验验证Apt H@PLGA@UK NBs的生物安全性。4.狭窄法制备40只急性DVT动物模型,按照不同治疗方式均分5组。Control组:无任何治疗处理;US组:单纯低功率聚焦超声辐照;UP组:低功率聚焦超声辐照+PLGA NBs;UPU组:低功率聚焦超声辐照+PLGA@UK NBs;UAPU组:低功率聚焦超声辐照+Apt H@PLGA@UK NBs。5.每次治疗结束后对急性DVT兔进行二维超声(two-dimensional ultrasound,2DUS),彩色多普勒(color doppler flow imaging,CDFI),超声造影(contrast enhanced ultrasound,CEUS)评估,并记录血栓最大长度和最大厚度作为定量评价溶栓治疗效果的指标。6.造模前,治疗前以及最后一次治疗后检测兔外周血凝血四项:凝血酶时间(thrombin time,TT)、凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)、纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)含量,和D-二聚体(D-dimer)含量,最后取下腔静脉血栓组织进行病理HE染色观察。【结果】1.不同致孔剂方案和不同致孔剂浓度制得的PLGA NBs冻干粉成品率均高达80%。光学显微镜观察各组PLGA NBs呈大小均一、均匀分散的圆形微泡,高致孔剂浓度组的微泡Bioactive char表面更粗糙;电子显微镜观察PLGA NBs呈规则球型,双致孔剂组的PLGA NBs球体表面呈孔道状结构,内部呈空腔结构,高致孔剂浓度组的PLGA NBs球体表面孔道结构更多,孔道更大,内部空腔结构更大;10%NH_4HCO_3组的PLGA NBs相比其他组粒径更小,Zeta电位更大(均有P<0.05),其他各组PLGA NBs粒径分布、Zeta电位之间无统计学差异(均有P>0.05)。2.多孔PLGA NBs的超声成像效果良好。随致孔剂的添加以及致孔剂浓度的增大,多孔PLGA NBs的超声造影峰值强度逐渐增大(均有P<0.05),10%NH_4HCO_3组和8%NH_4HCO_3组制备的PLGA NBs的超声造影PI无明显差异(P>0.05)。PLGA NBs的超声造影PI随浓度增高而增大,浓度达到15mg/m L时,PI最高。3.PLGA@UK NBs,Apt H@PLGCH-223191 MWA@UK NBs的粒径均高于PLGA NBs的粒径(均有P<0.05),各组微泡的Zeta电位无明显差异(均有P>0.05)。PLGA@UK NBs中UK的包封率为78.66%,载药量为30.25%,Apt H@PLGA@UK NBs中Apt H的结合率为66%。不同浓度Apt H@PLGA@UK NBs的培养基孵育人脐静脉内皮细胞存活率达90selleckchem Gefitinib%以上;注射相同浓度的Apt H@PLGA@UK NBs实验兔的生化指标均在正常范围内,重要脏器切片都与正常对照组无明显差别,细胞结构正常,无损伤。4.Control组、US组的血栓最大长度随时间延长逐渐增长(均有P<0.05),UP组Day3时血栓较Day1时增长(P<0.05),Day6时血栓长度无明显变化(P>0.05),UPU组血栓长度在Day3时增长(P<0.05),Day6时缩短至与Day1时长度一致(P>0.05),UAPU组的血栓最大长度随时间延长逐渐缩短(均有P<0.05)。Control组血栓最大厚度随时间延长未发生明显变化(均有P>0.05),US组、UP组血栓最大厚度在Day3时无变化(均有P>0.05),Day6时缩小(均有P<0.05),UPU组、UAPU组血栓最大厚度随时间延长逐渐缩小(均有P<0.05)。5.造模前,治疗前各组实验兔的凝血四项和D-dimer含量差异无统计学意义异(均有P>0.05);治疗后UPU组和UAPU组的PT、APTT、TT均较其他三组延长(均有P<0.05),UAPU组的TT、PT较UPU组延长;UPU组和UAPU组的FIB含量、D-dimer含量均较其他三组减低(均有P<0.05),UAPU组的FIB含量、D-dimer含量较UPU组减低(均有P<0.05)。Control组、US组、UP组的PT、APTT、TT在治疗前后无明显变化(均有P>0.05),FIB含量、D-dimer含量在治疗前后均较造模前增高(均有P<0.05);UPU组和UAPU组治疗后的PT、APTT、TT较治疗前和造模前均延长(均有P<0.05),治疗前的FIB含量、D-dimer含量均高于造模前和治疗后(均有P<0.05)。【结论】1.改良的双乳化溶剂挥发法可制备出粒径均一,分散性良好的多孔纳米微泡造影剂,超声成像效果好,且成品率高;2.内水相致孔剂浓度8%,造影浓度为15mg/m L的PLGA NBs超声造影峰值强度最高,显影效果最好。3.Apt H@PLGA@UK NBs符合纳米微泡标准,UK的包封率高,载药量大,Apt H的结合率高,同时具有高细胞安全性及良好生物相容性。4.Apt H@PLGA@UK NBs可用于急性DVT的诊断和治疗评估,对急性DVT治疗效果好,达到临床溶栓治疗的标准,同时可以改善因血栓导致的凝血指标异常。