目的:基于中医肾脑同治理论,应用多组学分析联合网络药理学探求鹿茸VA(Cornu Cervi Pantotrichum)调控肾-脑轴改善衰老引发认知障碍的作用及其药效活性物质基础。方法:1.基于网络药理学鹿茸抗衰老认知障碍的作用研究:通过TCMID(Traditional chinese medicines integrated database)数据库获得VA的化学成分,通过Swiss Target Prediction数据库获得VA的靶点,并对VA相对应的靶点进行GO(Gene ontology)富集。利用Drug Bank数据库和OMIM(Online mendelian inheritance in man)数据库获取衰老疾病相关靶点,采用Cytoscape 3.9.0,建立VA-活性成分-靶点-衰老网络。通过STRING数据库,建立PPI的调控互作网络,应用Metascape,进行GO及KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)的生信分析,通过Bio GPS数据库评价VA靶点在各组织器官中的表达情况。2.基于转录组学鹿茸抗衰老认知障碍的机制研究:将ICR小鼠随机分为空白组(Control)、模型组(Model)、维生素E阳性对照组(Positive)、鹿茸全粉低剂量组(VA1)和鹿茸全粉高剂量组(VA2)。皮下注射D-半乳糖溶液(D-gal),建立衰老认知障碍动物模型。应用Morris水迷宫及避暗穿梭实验对衰老小鼠行为学进行检测。采用HE染色,观察衰老小鼠的脑组织形态,Western blotting法检测衰老小鼠脑组织中PSD95(Postsynaptic density protein 95)、SYN(Synapsin)、PAN(Pantophysin)神经突触蛋白及铁死亡相关蛋白GPX4(Glutathione peroxidase 4)的表达水平。生化试剂盒检测衰老小鼠肾脏组织中ATP(Adenosine triphosphate)含量,应用Western blotting检测衰老小鼠肾脏组织中抗衰老蛋白klotho、FGF21(Fibroblast growth factor 21)的表达水平,采用RNA-seq技术对小鼠脑组织、肾脏组织进行转录组学检测;采用ELISA(Enzyme linked immunosorbentassay)分别检测衰老小鼠脑组织中CRH(Corticotropin releasing hormone)、ACTH(Adreno-cortico-tropic-hormone)含量、肾上腺组织中CORT(Corticosteroids)的含量、以及血清中CRH、ACTH、CORT的含量,检测肾上腺组织中c AMP(Cyclic adenosine monophosphate)和PKA(PrMedical adhesiveotein kinase A)的表达水平。3.基于灰色关联度分析鹿茸抗衰老认知障碍的物质基础研究:将SD自然衰老大鼠随机分为模型组(Model)、10批次鹿茸样品1-10组(VA1-VA10),每组10只。除Model组外分别灌胃给予181 mg/kg VA溶液,持续给药30天,应用Morris水迷宫实验和新物体识别实验进行行为学检测,采用凯氏定氮法测定10批VA样品中的总蛋白含量,紫外分光光度法检测10批VA中总多糖、总磷脂含量,高效液相色谱法(HPLC)检测10批VA中雌二醇、睾酮、孕酮的含量,并进行方法学考察。ELISA检测10批VA组衰老大鼠血清中的CRH、ACTH、CORT表达量,SPSSAU网站进行灰色关联度分析,探究VA中总蛋白、总多糖等核心物质与神经内分泌之间的关联性。通过酶解法提取VA中的蛋白活性成分命名为鹿茸肽(VAT),将VAT进行多肽组学的检测,探究鹿茸中的活性肽段,进一步明确肽段所代表的活性蛋白。结果:1.网络药理学分析鹿茸抗衰老认知障碍的作用结果:通过TCMID和Swiss Target Prediction数据库,发现VA中富含神经节苷脂(ganglioside)、半乳糖胺(galactosamine)、雌二醇(estragole)等在内的21种活性成分,对应767个作用靶点;通过GO功能富集,发现VA主要在神经内分泌调节、神经系统、对激素的调节、氧化应激及生长发育等方面,尤其在中枢神经系统、内分泌系统的调节、肾脏发育等方面均发挥着重要的调控作用;共检索到衰老疾病靶点1036个,与VA交集靶点有141个;构建VA-活性成分-靶点-衰老网络图,构建PPI蛋白互作网络得到PRKACA(c AMP-dependent protein kinase alpha-catalytic subunit)、TNF(TNF-alpha)、CASP3(Caspase 3)、HSP90AA1(Heat shock protein HSP 90-alpha)、APP(Beta amyloid A4 protein)等核心靶点,进一步说明VA可通过调控这些核心靶点发挥防衰作用;GO富集分析中,发现VA主要参与包括化学突触传递的调节、环核苷酸分解代谢过程、衰老过程的调节、对β-淀粉样蛋白的发展过程、神经元死亡的调节等生物过程,发挥激酶结合、3′-5′-环核苷酸磷酸二酯酶活性等分子功能,涉及到细胞质核周区、神经元细胞体、突触、核膜腔等细胞组分;KEGG通路富集分析,主LY-188011要涉及长寿调节途径、PI3K-AKT信号通路、阿尔茨海默病等信号通路;通过器官定位分析发现VA靶点主要在下丘脑、垂体、肾上腺、肾等器官中高度表达;说明VA可通过调控相关核心靶点及信号通路从而发挥延缓衰老的作用。2.鹿茸抗衰老认知障碍的作用机制:Morris水迷宫和避暗穿梭实验发现给予VA干预后可改善衰老小鼠的学习记忆能力及空间行为功能;VA组小鼠海马区神经元排列整齐有序、紧密;VA可提高脑组织突触相关蛋白PSD95、SYN、PAN的表达水平,增加GPX4的表达水平;说明VA具有保护神经元的作用。VA可提高衰老小鼠肾组织中ATP的含量,增加klotho、FGF21的表达水平,说明VA具有补肾功能。通过RNA-seq转录组学对小鼠的脑组织和肾脏组织分别进行了检测,发现脑组织、肾组织的差异表达基因主要富集在神经元突触、核质体等细胞组分,参与化学突触传递等生物过程,涉及催化活性、信号转导活性及抗氧化活性等分子功能,与醛固酮调节、寿命调节及类固醇生物合成等信号通路相关。联合网络药理学和转录组学的分析,VA主要是通过调节HPA轴中激素分泌,维持神经内分泌稳态。进一步验证发现VA可降低肾上腺组织内激素调节因子c AMP、PKA的表达水平,降低脑组织中CRH、ACTH的含量、肾上腺组织中CORT的含量、及血清内CRH、ACTH、CORT的含量。3.灰色关联度分析鹿茸抗衰老认知障碍的物质基础:行为学实验结果表明10批VA均可显著性缩短衰老大鼠潜伏期和总路程,有效提高衰老大鼠对新物体的识别指数,说明VA可改善衰老大鼠的空间记忆能力和对新物体的识别能力;凯氏定氮法检测10批VA样品点击此处中总蛋白的含量在49.0226-52.9899%;总多糖含量在3.223-3.722 mg/g;总磷脂含量在0.1743-0.2469%;HPLC检测10批VA样品中雌二醇含量在0.7072-1.2469 ng/g,睾酮的含量在0.3653-0.5946 ng/g,孕酮的含量在0.2869-1.1426 ng/g,方法学考察实验中RSD值均≤2.0%,所测结果均符合定量分析的要求;通过ELISA检测,10批VA样品中CRH含量在24.85-56.95 pg/ml,ACTH的含量在20.80-41.95 pg/ml,CORT含量在5.20-13.98μg/d L;通过灰色关联度分析,VA中总蛋白是VA中调节内分泌稳态的核心活性物质。通过酶解法提取VAT并进行LC/MS的分析,VAT中共鉴定出1824条多肽,多肽分子量分布主要集中在0.5-2.0k Da;多肽长度集中分布在7-14 AA;结合Uniprot数据库共定位到胶原蛋白、糖蛋白、转铁蛋白、白蛋白等225个蛋白,通过对肽段对应的蛋白进行生信分析,VAT主要发挥肽酶调节活性、生长因子结合、氧化还原酶活性、类固醇结合等分子功能;参与肽酶活性、催化活性调节等生物过程;涉及到含胶原蛋白的细胞外基质等细胞组分。结论:本研究结合网络药理学、RNA-seq转录组学和多肽组学等技术,基于中医肾脑同治理论,初步阐释VA通过调控肾-脑轴改善衰老认知障碍的作用,明确VA改善衰老引发认知障碍的核心物质为VAT,并进一步确定了VAT中的核心活性肽段,为VA防治衰老提供科学理论依据。