目的:胰腺癌作为消化道恶性肿瘤,在临床上十分常见,该疾病预后较差,在患者中的5年生存率低于10%。本研究的目的是从中药中寻找高效低毒的天然药物,并综合应用网络药理学方法探索活性中药升麻治疗胰腺癌的潜在作用及可能机制,为胰腺癌的中药干预提供新的思路。方法:确定目标活性中药:应用CCK8法考察常用中药(100μg/ml)对Aspc-1和Panc-1细胞的抑制活性。测定活性中药升麻抑制Aspc-1和Panc-1的IC_(50)。升麻抗胰腺癌活性的体外评价:升麻对Aspc-1和Panctumor suppressive immune environment-1细胞迁移的影响通过细胞划痕实验进行考察;细胞克隆集落形成实验考察升麻对Aspc-1和Panc-1细胞增殖能力的影响;使用Western Blot检测升麻处理后Aspc-1和Panc-1细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2,BAX,casepase-3,casepase-9)的表达变化,以此来验证升麻对胰腺癌细胞凋亡的影响。运用网络药理学探索升麻抗肿瘤作用的潜在活性成分和作用机制:对TCMSP、Dis Genet、Gene Cards、OMIM等数据库中现有的数据进行检索,根据口服生物利用度,类药性等指标进行筛选,进而获取药物有效成分及与有效成分相关的作用靶点,并且进行胰腺癌疾病相关靶点的获取;通过Cytoscape软件导入上述步骤得到的结果,构建“升麻-胰腺癌-靶点”网络。将“升麻-胰腺癌-靶点”数据集中的靶点信息导入String数据库中构建PPI网络,整合这一数据集中包含的“蛋白-蛋白ABT-263抑制剂相互作用”。将获得的升麻-胰腺癌核心靶点导入基因列表,进行细胞生物功能和KEGG通路分析,对相关靶点有关的生物功能进行注释。通过对调控网络图中的因子进行Western Blot验证,从而确定升麻发挥抗胰腺癌活性的作用机制。结果:在筛选的多种中药中,升麻能够同时降低Aspc-1和Panc-1两种细胞的存活率,100μg/ml时两种细胞的存活率均低于30%;而且,升麻对胰腺癌细胞存活率的抑制具有浓度依赖性和时间依赖性,处理72h后的IC_(50)分别为10.78μg/ml(Aspc-1)和48.76μg/ml(Panc-1)。细胞划痕迁移实验结果显示与对照组相比,加入升麻的实验组中划痕两侧细胞向中间融合被抑制,且随加入升麻浓度的提高,抑制程度更为明显。细胞克隆集落形成实验结果显示,与对照组相比,加入升麻的实验组可观察到的结晶紫染色细胞明显减少,且随着药物浓度的升高,染色细胞数量更少。Western Blot结果表明,经过升麻处理的胰腺癌细胞的凋亡相关蛋白表达随时间显著增强,而抗凋亡相关蛋白的表达明显减少。这些结果表明,胰腺癌细胞的增殖能力和迁移能力受到了升麻的抑制作用,且升麻对胰腺癌细胞的凋亡起到了促进作用。网络药理学分析显示,升麻相关靶点与胰腺癌相关靶点根据口服生物利用度和类药性排序,得到包括“PPARγ、GSK3β”在内的21个的交集靶点,这21个靶点与升麻活性成分、胰腺癌疾病共同具有相关性。通过Western Blot对Cycling D1、Cycling E1、COX2、NF-κB等相关蛋白表达进行检测,发现这些与PPARγ、GSK3β两个靶点相关的蛋白都在升麻作用下受到了影响,验证了升麻发挥抗肿瘤活性的作用靶点。结论:1.多种中药具有体外抑制胰腺癌细胞活性,其中升麻具有较强的抗肿瘤活性。2.升麻抑制Aspc-1和Panc-1细胞的增殖和迁移,诱导两种胰腺癌Puromycin细胞凋亡。3.升麻可能是通过PPARγ和GSK3β信号通路发挥体外抗胰腺癌活性。