新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发的新冠肺炎疫情已经成为全球性灾难。尽管全球为了控制SARS-CoV-2传播和感染做出了巨大努力,但SARS-CoV-2变异株的不断出现,特别是具有极强传播能力的Omicron变异株的出现,对疫情防控带来了极大挑战。由于新型靶向抑制剂研发周期较长,SARS-CoV-2特效治疗性抑制剂至今依然寥寥无几。3-糜蛋白酶样蛋白酶(3CLpro)是SARS-CoV-2的主要蛋白水解酶,在其生命周期中发挥重要作用,且其基因序列高度保守、突变率低,已经成为SARS-CoV-2的研究热点。近来,已报道多种3CLpro活性评价体系和抑制剂筛选方法,但普遍存在易受非特异性化合物干扰和不适用于高通量筛选等问题。此外,不断出现CH-223191细胞培养SARS-CoV-2变异株的3CLpro突变也引发了人们对3CLpro抑制剂耐药性的担忧。因此,亟需开发出一种更加灵敏、可靠、简便的3CLpro活性检测方法,用于靶向抑制剂的筛选、鉴定及其3CLpro突变体抑制剂敏感性的检测。本研究基于3CLpro诱导的细胞毒性和报告基因表达抑制可被突变或抑制剂逆转的发现,建立了一种基于细胞的新型3CLpro活性检测方法,其利用正交双报告基因的信号增益检测可以定量、灵敏地检测细胞内3CLpro活性。利用该检测方法,阳性抑制剂GC376和PF-00835231表现出良好剂量依赖性的3CLpro抑制活性,而非3CLpro特异的细胞凋亡或焦亡通路抑制剂未表现出对3CLpro活性的抑制,表明宿主细胞死亡通路抑制剂不会在检测中造成干扰。进一步对来自骨架化合物库、天然产物化合物库和蛋白酶抑制剂化合物库的共计3785个化合物的高通量筛选,发现了3个命中化合物,均为已报道的3CLpro抑制剂。其中S-217622的3CLpGDC-0068试剂ro抑制活性最强,而Boceprevir和Z-FA-FMK仅有弱至中等的抑制活性。在45个已报道的3CLpro抑制剂中,除了PF-07321332、GC376和、PF-00835231,及上述3个命中化合物以外,其余39个化合物包括Ebselen和Masitinib,均未显示出3CLpro的抑制活性,提示了其可能并非3CLpro特异性的抑制剂。此外,我们还对7个广泛存在的SARS-CoV-2流行变异株的3CLpro突变体进行了活性和抑制剂敏感性的检测。结果显示,与野生型3CLpro相比,Omicron 3CLpro P132H突变体活性显著降低约31%,GC376、PF-00835231、S-217622和PF-073213327对7个突变体的IC_(50)值与其对野生型3CLpro的IC_(50)值相当或更低。然而,在其中3个突变体PF-07321322(P132H)和S-217622(G15S,T21I)剂量响应曲线的斜率降低,显示了其在高浓度时抑制活性的下降,提示了其可能与抑制剂敏感性改变有关。综上,本研究建立了一种基于正交双报告基因的信号增益的活细胞内3CLpro活性测定方法。相比已有报道的其它方法,该方法具有更好的可靠性、灵敏性和便捷性,可避免化合物非特异性的脱靶效应和来自化合物本身对的信号干扰。利用该方法我们开展了化合物库3CLpro抑制剂的鉴定和高通量筛选,并研究了3CLpro突变对其活性与抑制剂敏感性的影响。鉴于该方法所展现的实用性和多功能性,相信本研究将有nerve biopsy助于对3CLpro的进一步深入研究和新型3CLpro靶向抑制剂的研发。