幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染与一系列消化道疾病有关,并且是胃癌的Ⅰ类致癌物,对公共卫生健康造成了巨大的威胁。多年来由于抗生素的大规模和不合理使用,使得幽门螺杆菌耐药率越来越高,因此需要采用更精确和更具有成本效益的方法检测抗生素的耐药情况,以达到幽门螺杆菌的首次根除率达到首战告捷的目标。幽门螺杆菌主要定植于宿主胃黏膜上皮细胞,会由于食管反流和自然排泄同时存在于口腔和粪便中。相比于唾液中幽门螺杆菌含量低和胃黏膜取样不便,作colon biopsy culture为一种非侵入性的检测方式,利用粪便样本进行幽门螺杆菌基因检测正受到临床的高度关注。因粪便中幽门螺杆菌的含量极低及其DNA片段化,并含有大量其他种类细菌和抑制剂等因素,在基因检测方面存在一定的难度。PBP1在幽门螺杆菌中突变率较高,虽然个别突变或突变组合可能导致阿莫西林的耐药,但如何指导临床用药尚无确切结论。另外,国人幽门螺杆菌rdx A耐药突变率很高,而利福霉素类药物在国内未用于幽门螺杆菌根除治疗。有鉴于此,本研究选择了23S r RNA、gyr A、16S r RNA、por D和oor D基因进行了粪便样本幽门螺杆菌耐药突变检测研究。本研究使用两步法巢式PCR联合一代测序技术检测粪便样本中的幽门螺杆菌耐药突变,分析其诊断性能。在此基础上,进一步使用多重PCR扩增子靶向测序技术,探索新一代测序(next-generation sequencing,NGS)在检测粪便样本中幽门螺杆菌耐药突变的可行性。主要的研究结果如下:1.通过比较市售的三种粪便DNA提取试剂盒的提取效果,发现Magen试剂盒更适合用于粪便样本中DNA获悉更多的提取。2.利用巢式PCR联合一代测序技术,在135例粪便样本中,共检测出63例样本携带幽门螺杆菌,阳性率为46.67%。幽门螺杆菌23S r RNA、gyr A、16S r RNA的耐药突变率分别为65.08%、38.10%和9.52%,呋喃唑酮耐药突变率为37.93%(por D和oor D共突变)。本研究的抗生素耐药突变率总体偏高,可能是研究样本量较少,系样本选择偏差所导致,需要进一步扩大样本研究确认。3.为了评估巢式PCR联合一代测序对于幽门螺杆菌的诊断性能,以~(13)C呼气试验和粪便幽门螺杆菌抗原检测作为对比,对一致性检验指标(Kappa)和受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线进行分析,发现23S r RNA、LGK-974体内gyr A、16S r RNA、por D和oor D基因的Kappa值均大于0.830,ROC曲线下与坐标轴围成的面积(area under curve,AUC)值均大于0.910,提示巢式PCR联合一代测序具有很好的诊断性能。4.通过多重PCR扩增子靶向测序均能成功检出63例幽门螺杆菌阳性粪便样本中的23S r RNA、gyr A、16S r RNA、por D和oor D基因,检测灵敏度高于巢式PCR联合一代测序技术。23S r RNA、gyr A耐药突变率高达74.60%和47.62%,四环素16S r RNA与呋喃唑酮的耐药突变率分别为9.52%和34.92%。5.为了探究多重PCR扩增子靶向测序用于粪便中幽门螺杆菌耐药突变的可行性,与巢式PCR联合一代测序的耐药突变结果进行比较。与一代测序比较,扩增子靶向测序能灵敏地检测出低等位基因频率的耐药突变,这也是两者检测结果不一致的主要原因。并且随着等位基因频率的升高,两者检测结果的一致性也在不断升高。23S r RNA、gyr A、16S r RNA、por D和oor D基因的Kappa值均大于0.747,AUC值均大于0.875。NGS粪便幽门螺杆菌耐药基因检测具有很高的诊断价值,可以作为幽门螺杆菌感染患者的新型非侵入性检测方法,为临床上幽门螺杆菌根除治疗提供可靠的技术保证。该论文有图36幅,表41个,参考文献147篇。