脂肪酶作为一种绿色的生物催化剂,因其优异的催化特征而被广泛的应用于食品、医药、皮革、化工与环境等工业领域。高温、有机溶剂、极端pH等特殊环境因素则限制了脂肪酶在这些领域的进一步应用。筛选鉴定能够极端环境,特别是热稳定性的脂肪酶引起了研究者的广泛关注。本研究在实验室之前的基础上表征了一个嗜热玫瑰红球菌(Thermomicrobium roseum DSM 5159)来源的嗜热脂肪酶,并且对其表达系统、晶体结构、耐热框架和催化效率进行了研究,获得主要结果如下:(1)对来自嗜热玫瑰红球菌(T.roseum DSM 5159)的一个脂肪酶基因进行了重组表达和鉴定。分别在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)和枯草芽孢杆菌B.subtilis W600两个系统中表达,命名为TrLipE和TrLipB。肽质量指纹图谱分析进一步证实了TrLipE和TrLipB的成功表达。不同表达系统表达的TrLipE和TrLipB均在较宽的温度和pH范围内显示出显著的稳定性。同时,TrLipE和TrLipB在由水和有机溶剂组成的混合体系中均表现出显著的耐受性。酶的表征结果表明,TrLipB具有更好的酶促性能,特别是耐热性和耐有机溶剂性。圆二色谱(CD)分析结果selleckchem Galunisertib显示二者的二级结构组成略有不同。同时通过Nano-DSC分析进一步验证了TrLipE和TrLipB的热稳定性。进一步对TrLipE和TrLipB底物特异性和酶促动力学进行了分析,结果表明了TrLipE和TrLipB对不同碳链长度的对硝基苯酯具有不同催化性能。此外,固定化TrLipB被证实可以进行酯交换反应,其转化三丁酸甘油酯和甲醇生成丁酸甲酯的摩尔转化率最高为23.32%,这说明TrLipB具有极大的潜力应用于生物柴油的生产。(2)鉴于TrLipB的优异的特征,通过坐滴气相扩散法对TrLipB进行了结晶。在经过质量检测后对TrLipB结晶条件进行筛选和优化,最终获得了TrLipB的晶体。优化后的晶体筛选条件为1 mol/L的琥珀酸、0.1 mol/L的HEPES、1%的PEG 2000 MME(w/v)、pH 7.0。进一步X-射线衍射获得的数据经XDS程序处理之后可知TrLipB晶体的分辨率达到2(?),属于P43212空间群。结构分析结果显示,TrLipB的晶体结构符合典型α/β水解酶结构。进一步的结构比较结果表明TrLipB和Bacillus cohnii strain N1来源的HSL家族的酯酶具有较高的结构相似性。(3)通过将TrLipB结构表面相对柔性区域(Loop)的脯氨酸(Pro)依次替换成甘氨酸(Gly),研究了Loop区域的Pro对TrLipB耐热框架的重要作用。结果发现,多数突变体的热稳定性显著降低,且稳定性随突变位点的增加而进一步下降。进一步的酶促反应结果表明大部分突变体的催化效率显著降低。但是突变体P48G和P49G催化效率却得到了提高(130%左右)。分子动力学模拟(MD)结果表明,突变体具有较高的B-因子和RMSD值,而且这些突变体的二级结构、回旋半径(R_g)、H-键和溶剂可及表面积均展现出了显著的改变,这些结果表明Loop区域的Pro对TrLipB的耐热框架具有重要作用。此外,通过“盖子”交换构建了了18个嵌合体,嵌合体的最优温度和它们在最优温度下的半衰期同样小于TrLipE。进一步的MD模拟结果表明,相比于原始酶,嵌合体具有较大的柔性和相对较差的热稳定性,这表明脂肪酶的“盖子”结构域对其热稳定性同样具有重要的作用。(4)通过与其它脂肪酶进行N-端“盖子”结构的交换改变了TrLipE嵌合体的酶活力和底物特异性。结果表明,与PR-171纯度野生TrLipE相比,18个嵌合体具有与TrLipE相似的pH耐受范围和最优pH值。并且,各嵌合体对不同链的对硝基苯酚酯底物亲和力(K_m)及催化效率(k_(cat)/K_m)各异。在底物特异性方面,嵌合体TrL-2、TrL-3、TrL-17、TrL-18可以特异性的水解原始酶TrLipE不能水解的底物4-硝基苯安香息酸酯。其中嵌合体TrL-17拥有最高的催化效率。为了进一步提高TrL-17的催化能力,依据TrL-17与底物的分子对接结果同时采用降低酶与底物复合物结合能的策略对相应的氨基酸进行突变。结果表明,突变体催化4-硝基苯安香息酸酯的效率强于野生的TrL-17,其new infections催化效率(k_(cat)/K_m)最高达到了TrL-17的3倍多。