双酚基丙烷又称双酚A(Bisphenol A,BPA),是一种重要的工业化合物,常用于日常塑料用品的制造领域。已有证据表明,BPA作为一种环境内分泌干扰物,可通过消化道、呼吸道、皮肤等途径进入机体,与细胞表面受体结合进而影响组织器官,引起哺乳动物的生殖内分泌和代谢功能紊乱。肝脏作为哺乳动物重要的代谢器官,参与调控机体的糖脂代谢和胆汁分泌。有研究发现,长期摄入BPA会使动物肝脏发生脂肪变性,破坏哺乳动物肝脏的糖脂代谢稳态,并最终诱发非酒精性脂肪肝的出现。然而,关于BPA暴露损害肝脏糖脂代谢的具体作用机制目前仍不清楚。生物钟作为一种保守的生命活动调控系统,参与调节多种糖脂代谢关键基因的节律性表达,从而在维持哺乳动物糖脂代谢稳态过程中发挥重要作用。本课题组前期研究发现,B更多PA通过扰乱生物钟基因Nr1d1的表达进而抑制小鼠睾酮合成,但BPA是否影响小鼠的肝脏生物钟和糖脂代谢功能目前仍不清楚,亟需进一步的探究。本研究首先利用野生型雄性小鼠和小鼠肝实质细胞(AML12细胞)系建立了BPA暴露模型,然后使用流式细胞术、q PCR、BODIPY荧光染色、Western blot(WB)、Kronos AB-2550细胞实时生物荧光测定系统、试剂盒定量检测等多种实验技术,系统探究了BPA对小鼠肝脏生物钟系统和糖脂代谢功能的影响,具体结果如下:1.CCK8和流式细胞术检测结果表明,对AML12细胞活力和凋亡无显著影响的最大BPA处理浓度为100μM,后续使用该浓度处理AML12细胞。q PCR检测结果表明,BPA处理显著改变了生物钟基因(Bmal1、Nr1d1、Per2、Dbp)和糖脂代谢相关基因(Srebp1c、Fasn、Hmgcr、Cd36、Lpin1、Pparα、Pparγ、Elovl6、Glut2)m RNA在非同步化AML12细胞的表达;BODIPY荧光染色结果表明,BPA处理对AML12细胞的中性脂肪含量无显著影响Medial pivot;WB结果表明,BPA处理AML12细胞24 h后,显著降低了生物钟蛋白BMAL1的表达;细胞实时生物荧光测定系统结果表明,BPA处理显著降低了Per2::Luc小鼠肝脏组织块Per2::Luc的荧光素酶活性;将AML12细胞进行同步化处理后,对照组和BPA处理组的生物钟基因(Bmal1、Nr1d1)m RNA表达量均具有显著的节律性变化,BPA处理显著提高了生物钟基因Bmal1的表达量。同时,BPA显著抑制了Hmgcr m RNA在AML12细胞的表达,促进了Pparαm RNA在AML12细胞的表达。2.为深入探究BPA对小鼠生物钟系统与糖脂代谢功能的影响,通过查阅参考文献进一步确定了使用50μg/kg/day BPA、持续灌胃小鼠6周的造Proteases抑制剂模方法。灌胃过程中,记录小鼠体重(每隔一天)、采食量和饮水量(每隔两天)的变化。灌胃6周后,使用小鼠转轮节律监测系统检测小鼠活动节律。小鼠转轮节律监测系统、采食量及饮水量的结果显示,与对照组相比,BPA处理组小鼠内源性周期显著延长,饮水量和采食量均显著升高;全天血糖检测、葡萄糖耐量和胰岛素耐量实验结果表明,BPA处理组与对照组相比全天血糖浓度显著下降,BPA处理组葡萄糖的代谢速率和胰岛素敏感性均显著低于对照组,BPA处理组的曲线下面积在葡萄糖和胰岛素耐量实验中均显著高于对照组;试剂盒检测结果显示,肝糖原含量、血清及肝脏甘油三酯含量在对照组和BPA处理组中均无显著差异;q PCR和WB结果表明,对照组和BPA处理组小鼠肝脏生物钟基因(Bmal1、Nr1d1、Dbp和Per2)m RNA表达量均具有昼夜节律性表达,但BPA处理组生物钟基因m RNA表达的振幅和相位均发生了改变;BPA降低了小鼠肝脏生物钟基因Bmal1和脂代谢相关基因Srebp-1c、Fasn、Hmgcr及Elovl6 m RNA的表达,却促进了生物钟基因Dbp、Nr1d1和糖脂代谢基因G6pc、Cyp7a1及Cd36 m RNA的表达。此外,BPA处理显著降低了BMAL1和DBP蛋白的表达量,但显著升高了NR1D1、FASN和SREBP1C蛋白的表达。综上所述,BPA处理显著改变了生物钟基因和部分糖脂代谢相关基因在AML12细胞的表达,并从在体水平上导致小鼠内源性周期显著延长,引起小鼠血糖降低与胰岛素敏感性下降,破坏了血糖稳态。同时,BPA处理扰乱了小鼠肝脏生物钟基因(Bmal1、Nr1d1和Dbp)和糖脂代谢相关基因(Srebp1c、Cd36、Elovl6、G6pc和Glut2)的表达。本研究为深入解析BPA影响肝脏生物钟与糖脂代谢的作用机制提供了前期基础,为从时间毒理学的角度探究BPA的肝脏毒性提供一定的理论支撑。