结直肠癌是全球发病率排名第三、致死率排名第四的恶性肿瘤。结直肠癌约占全世界每年诊断的所有癌症及癌症相关死亡的10%,对人类的健康造成严重的威胁。因此阐明结直肠癌恶性进展的机制以及开发新的治疗策略对于改善结直肠癌患者预后至关重要。60%的结直肠癌患者携带TP53基因突变,是导致预后不良的重要原因。TP53基因突变不仅使P53蛋白丧失转录激活抑癌基因的能力,甚至赋予P53蛋白新的促癌功能。TP53基因突变能够促进肿瘤糖酵解,也是维持肿瘤干性特征和导致化疗耐药的关键因素。然而对突变型P53蛋白的靶向治疗一直被认为是最难的医学问题之一,因此探究TP53突变型结直肠癌维持高水平糖酵解及化疗耐药的具体机制,对寻找新的治疗靶点和改善TP53突变型结直肠癌患者预后具有重要意义。Ubiquitin C-terminal hydrolases 3(UCHL3)属于泛素C端水解酶家族成员,通过从底物蛋白上切割多聚泛素链进而发挥其去泛素化酶活性。UCHL3可以稳定许多细胞生物学过程中的关键蛋白,在调控细胞分裂、DNA损伤修复以及肿瘤发生进展等方面具有重要的作用,然而关于UCHL3对结直肠癌糖酵解、干性特征维持及5-FU化疗耐药的影响目前还尚未见报道。因此本研究系统地探究了UCHL3在TP53突变结直肠癌高水平糖酵解、干性特征维持及5-FU化疗耐药中的作用及机制。第一部分鉴定参与介导结直肠癌TP53基因突变导致的高水平糖酵解的去泛素化酶目的:筛选出可能促进结直肠癌糖酵解的去泛素化酶家族成员,检测该去泛素化酶在野生型TP53和突变型TP53结直肠癌组织中的表达水平,并探究该去泛素化酶是否参与介导了TP53基因突变导致的高水平糖酵解。方法:1.通过去泛素化酶质粒库筛选联合生物信息学分析鉴定出可能促进结直肠癌糖酵解的去泛素化酶。2.过表达或者敲降/除野生型及突变型P53蛋白,通过Western blot检测筛选出的去泛素化酶表达水平。3.使用含有80对结直肠癌组织和癌旁组织的组织芯片,通过免疫组化检测该去泛素化酶在野生型TP53和突变型TP53结直肠癌组织中的表达水平。4.收集了43例新鲜结直肠癌和配对癌旁组织,抽提组织蛋白后Western blot检测该去泛素化酶表达水平。5.通过Seahorse XF系统检测了野生型和突变型P53蛋白以及该去泛素化酶对结直肠癌细胞糖酵解速率的影响。结果:1.去泛素化酶质粒库筛选联合生信分析显示USP44和UCHL3可能促进结直肠癌的糖酵解。2.TCGA数据库AG-221转录组数据显示,与野生型TP53肿瘤组织相比,突变型TP53肿瘤组织中UCHL3 mRNA表达水平明显升高,而USP44 mRNA表达水平无明显差异。3.Western blot结果显示:野生型P53蛋白能够抑制UCHL3的表达,而突变型P53蛋白能够促进UCHL3的表达。然而野生型和突变型P53蛋白对USP44的表达水平无显著影响。4.免疫组化结果显示:组织芯片中,突变型TP53结直肠癌组织中UCHL3蛋白表达水平明显高于野生型TP53结直肠癌组织。结直肠癌组织中UCHL3蛋白表达水平明显高于癌旁组织。Ⅳ期结直肠癌组织中UCHL3表达水平明显高于Ⅰ-Ⅲ期癌组织。结直肠癌组织中UCHL3高表达与患者不良预后显著相关。5.新鲜肿瘤组织抽提组织蛋白行Western blot检测结果显示:结直肠癌组织中UCHL3蛋白表达水平明显高于癌旁组织。6.在TP53野生型的HCT116细胞和TP53突变型的SW480细胞中敲降UCHL3Hepatocyte growth后,基础性糖酵解速率和补偿性糖酵解速率均出现明显降低。7.在HCT116(P53-/-)细胞中过表达野生型P53蛋白能够显著降低其基础性糖酵解速率及补偿性糖酵解速率,而过表达UCHL3能够部分回复野生型P53蛋白对糖酵解的抑制作用。在HCT116(P53-/-)细胞中过表达突变型P53蛋白能够显著升高其基础性糖酵解速率及补偿性糖酵解速率,而敲降UCHL3能够部分逆转突变型P53蛋白对糖酵解的促进作用。结论:1.去泛素化酶家族成员USP44和UCHL3可能促进结直肠癌的糖酵解。2.TP53突变型结直肠癌组织中UCHL3表达水平明显高于TP53野生型结直肠癌组织。USP44表达水平和TP53基因突变与否无关。3.UCHL3参与介导了结直肠癌TP53基因突变导致的高水平糖酵解过程。第二部分探究UCHL3是否参与介导了结直肠癌TP53基因突变导致的干性特征及5-FU化疗耐药目的:研究UCHL3对结直肠癌干性特征及5-FU化疗耐药的影响,以及UCHL3是否参与介导了TP53基因突变导致的5-FU化疗耐药。方法:1.使用TCGA数据库通过生信分析比较结直肠癌组织中UCHL3表达水平与肿瘤干性评分的关系。2.使用TP53突变型的SW480细胞通过成球培养富集肿瘤干细胞,通过Western blot比较了肿瘤干细胞和亲本细胞中UCHL3表达水平。3.通过慢病毒转染于TP53野生型的HCT116细胞中稳定过表达UCHL3,于TP53突变型的SW480细胞中稳定敲降UCHL3,并通过Western blot验证了UCHL3过表达和敲降的效率。4.使用成球培养实验检测UCHL3对TP53野生型的HCT116细胞和TP53突变型的SW480细胞的成球能力和自我更新能力的影响。5.通过流式细胞术及Western blot检测了UCHL3对TP53野生型的HCT116细胞和TP53突变型的SW480细胞的干性标记物表达水平的影响。6.使用TP53突变型的SW480细胞通过成球培养富集肿瘤干细胞,通过梯度稀释法配合基质胶注射NOD/SCID小鼠皮下进而检测UCHL3对TP53突变型的肿瘤干细胞的体内成瘤能力的影响。7.使用TCGA数据库通过生信分析分析了结直肠癌组织中UCHL3表达水平与肿瘤5-FU IC50评分和DNA修复通路的相关性。8.使用5-FU长期处理SW480细胞获得了5-FU耐药细胞株,通过Western blot检测了5-FU耐药株和亲本细胞中UCHL3表达水平。9.使用递增浓度梯度的5-FU分别处理TP53野生型的HCT1116细胞和TP53突变型的SW480细胞48小时,使用Western blot检测P53和UCHL3表达水平改变。10.使用CCK8法检测了UCHL3对TP53野生型的HCT116细胞和TP53突变型的SW480细胞的5-FU IC50值影响。11.使用流式细胞术检测了UCHL3对5-FU处理48小时后的TP53野生型HCT116细胞和TP53突变型SW480细胞的凋亡水平的影响。结果:1.在TCGA数据库中,UCHL3高表达的结直肠癌组织具有更高的肿瘤干性评分。2.肿瘤干细胞中UCHL3表达水平明显高于亲本细胞。3.成球实验结果显示:过表达UCHL3后,TP53野生型的HCT116细胞的成球能力和自我更新能力明显增强;敲降UCHL3后,TP53突变型的SW480细胞的成球能力和自我更新能力明显减弱。4.流式细胞术及Western blot检测显示:过表达UCHL3后,TP53野生型的HCT116细胞干性标记物CD44、CD133、SOX2、Oct4、Nanog的表达水平出现明显上调;敲降UCHL3后,TP53突变型的SW480细胞干性GSK1349572供应商标记物CD44、CD133、SOX2、Oct4、Nanog的表达水平出现明显下调。5.干细胞体内致瘤实验显示:敲降UCHL3后,TP53突变型肿瘤干细胞的体内成瘤比例出现明显下降,并且瘤体体积也较对照组明显减小。6.在TCGA数据库中,UCHL3高表达的结直肠癌组织也具有更高的5-FU IC50评分。此外,结直肠癌组织中UCHL3 mRNA水平和DNA修复通路呈正相关。7.5-FU耐药株中UCHL3表达水平明显高于亲本细胞。8.随着5-FU处理浓度的逐渐增加,野生型和突变型P53蛋白均被明显激活,在TP53突变型的SW480细胞中UCHL3表达水平逐渐升高,而在TP53野生型的HCT116细胞中UCHL3表达水平逐渐降低。9.过表达UCHL3后,TP53野生型HCT116细胞的5-FU IC50值明显升高,对5-FU治疗敏感性减低。敲降UCHL3后,TP53突变型SW480细胞的5-FU IC50值明显降低,对5-FU治疗敏感性增强。10.过表达UCHL3后,TP53野生型HCT116细胞的凋亡水平降低,对5-FU治疗敏感性减低。敲降UCHL3后,TP53突变型SW480细胞凋亡水平升高,对5-FU治疗敏感性增强。结论:1.UCHL3参与介导了结直肠癌TP53基因突变导致的干性特征。2.UCHL3参与介导了结直肠癌TP53基因突变导致的5-FU化疗耐药。第三部分UCHL3促进结直肠癌糖酵解、干性特征及5-FU化疗耐药的机制研究目的:探究UCHL3促进结直肠癌细胞糖酵解、干性特征及5-FU化疗耐药的具体机制。方法:1.使用SW480细胞通过免疫沉淀联合质谱方法寻找能够与UCHL3结合的蛋白。2.使用HCT116和SW480细胞通过免疫共沉淀方法验证UCHL3和ENO1是否能够相互结合。3.于HCT116细胞中转染Flag-UCHL3质粒以过表达UCHL3,于SW480细胞中转染Si RNA以敲降UCHL3,使用RT-qPCR及Western blot检测细胞中UCHL3及ENO1的蛋白及mRNA表达水平改变。4.于HCT116细胞中转染Flag-UCHL3质粒以过表达UCHL3,于SW480细胞中转染Si RNA以敲降UCHL3,使用放线菌酮(CHX)处理后于不同时间节点收取细胞并使用Western blot检测ENO1半衰期改变。5.于HCT116细胞中转染Flag-UCHL3质粒以过表达UCHL3,于SW480细胞转染Si RNA以敲降UCHL3,加入蛋白酶体抑制剂MG132处理12小时后使用ENO1抗体进行免疫沉淀实验,然后使用Western blot检测ENO1泛素化水平改变。6.于HCT116细胞中转染Flag-UCHL3质粒以过表达UCHL3,于SW480细胞转染Si RNA以敲降UCHL3,于加入蛋白酶体抑制剂MG132前后分别使用Western blot检测ENO1的表达水平改变。7.于41例结直肠癌患者组织标本中,使用免疫组化检测UCHL3和ENO1表达水平,并进行相关性分析。8.在稳定敲降UCHL3的RKO、SW480细胞中瞬时转染Flag-ENO1质粒以过表达ENO1。Western blot验证UCHL3敲降效率及ENO1过表达效率。9.在稳定敲降UCHL3的RKO、SW480细胞瞬时过表达ENO1,检测细胞的糖酵解水平、干性特征及5-FU化疗敏感性,方法同第二部分。结果:1.免疫沉淀联合质谱鉴定结果显示:在结直肠癌细胞中UCHL3蛋白和ENO1蛋白可能存在互相结合。2.免疫共沉淀实验结果显示:在HCT116细胞和SW480细胞中,UCHL3抗体能够将UCHL3蛋白和ENO1蛋白同时沉淀下来,ENO1抗体也能够将ENO1蛋白和UCHL3蛋白同时沉淀下来。3.在HCT116细胞中过表达UCHL3可以导致ENO1蛋白水平明显升高,而ENO1 mRNA水平无明显改变;在SW480细胞中敲降UCHL3可以导致ENO1蛋白水平明显降低,而ENO1 mRNA水平无明显改变。4.在HCT116细胞中过表达UCHL3后,ENO1蛋白的降解速率明显减慢,半衰期明显延长;在SW480细胞中敲降UCHL3后,ENO1蛋白的降解速率明显加快,半衰期明显缩短。5.HCT116细胞中过表达UCHL3后,ENO1蛋白泛素化水平明显降低;SW480细胞中敲降UCHL3后,ENO1蛋白泛素化水平明显升高。6.在HCT116和SW480细胞中使用了蛋白酶体抑制剂MG132以后,UCHL3丧失了其对ENO1蛋白水平的调控功能。7.Kendall’s tau-b检验显示结直肠癌组织中UCHL3和ENO1表达具有较好的正相关性(P<0.05),相关系数R=0.443。线性相关性分析也表明结直肠癌组织中UCHL3染色评分和ENO1染色评分呈明显正相关(P<0.001),相关系数R=0.614。8.过表达ENO1能够部分回复敲降UCHL3后对结直肠癌细胞糖酵解的抑制作用。9.过表达ENO1能够部分回复敲降UCHL3后对结直肠癌干性特征的抑制作用。10.过表达ENO1能够部分回复UCHL3敲降后对结直肠癌细胞5-FU化疗敏感性的影响。结论:1.在结直肠癌细胞中,UCHL3蛋白与ENO1蛋白互相结合。2.UCHL3发挥其去泛素化酶活性来降低ENO1蛋白的泛素化修饰水平,进而减弱了ENO1的泛素-蛋白酶体途径降解从而正向调控了ENO1的蛋白水平。3.UCHL3通过调控ENO1进而促进结直肠癌糖酵解、干性特征及5-FU化疗耐药。第四部分探究Pacritinib对TP53突变结直肠癌的糖酵解水平及5-FU化疗敏感性的影响目的:使用FDA批准上市的临床药物库筛选能够明显抑制TP53突变结直肠癌UCHL3表达的药物,通过“老药新用”为改善TP53突变结直肠癌患者预后提供新的治疗策略。方法:1.使用933种FDA批准上市的临床药物处理TP53基因突变的SW480细胞24小时,然后使用RT-qPCR检测细胞内UCHL3 mRNA表达水平改变情况,以筛选能够明显抑制UCHL3表达的药物。2.通过CCK8法检测了TP53突变结直肠癌细胞SW480和HT29的Pacritinib IC50值,并使用Western blot检测Pacritinib是否能够抑制TP53突变结直肠癌细胞的JAK2-STAT3通路及UCHL3和ENO1表达。3.使用递增浓度的Pacritinib药物处理SW480和HT29细胞12小时,使用RT-qPCR检测细胞中UCHL3及ENO1 mRNA表达水平改变。4.将HCT116细胞中野生型P53完全敲除并使用递增浓度的Pacritinib处理12小时,使用Western blot检测JAK2-STAT3通路活化及UCHL3和ENO1表达情况。5.在HCT116(P53-/-)细胞中过表达突变型P53蛋白并使用递增浓度的Pacritinib处理12小时,使用Western blot检测JAK2-STAT3通路活化及UCHL3和ENO1表达情况。6.使用5-FU处理SW480细胞48小时同时使用递增浓度的Pacritinib处理12小时,使用Western blot检测P53蛋白及JAK2-STAT3通路活化及UCHL3和ENO1表达情况。7.对80例结直肠癌患者的癌组织和癌旁组织芯片进行p-STAT3蛋白免疫组化染色,并比较野生型TP53和突变型TP53结直肠癌组织中p-ST AT3表达水平。此外还分析结直肠癌组织中p-STAT3和UCHL3表达水平相关性。8.使用NCBI联合JASPAR数据库预测了STAT3与UCHL3启动子区结合位点。通过染色质免疫沉淀(Ch IP)实验来验证STAT3能否与预测的结合位点相结合。并进行了双荧光素酶报告基因实验验证STAT3是否能够增强UCHL3启动子活性。9.通过Seahorse XF系统检测了Pacritinib对TP53突变结直肠癌细胞糖酵解速率的影响。10.通过克隆形成实验以及流式细胞术检测细胞凋亡实验研究Pacritinib能否增强TP53突变结直肠癌细胞对5-FU化疗的敏感性。11.使用TP53突变的结直肠癌细胞构建小鼠皮下移植瘤模型,随后分为四个治疗组:第一组给予空白对照;第二组给予5-FU 20mg/kg腹腔注射,每周3次;第三组给予Pacritinib 100mg/kg灌胃,每周3次;第四组给予5-FU和Pacritinib联合治疗。以在小鼠体内评估Pacritinib能否增强TP53突变结直肠癌细胞对5-FU化疗的敏感性。结果:1.Pacritinib药物能够抑制TP53突变结直肠癌细胞的JAK2-STAT3通路以及UCHL3和ENO1表达。2.结直肠癌野生型P53功能的缺失及突变型P53的激活均能通过活化JAK2-STAT3通路促进UCHL3和ENO1的表达,而使用Pacritinib药物治疗能够逆转这一过程。3.结直肠癌组织芯片免疫组化染色显示:突变型TP53结直肠癌组织中p-STAT3蛋白表达水平明显高于野生型TP53结直肠癌组织。此外结直肠癌组织中p-STAT3和UCHL3表达具有较好的正相关性。4.JAK2-STAT3通路活化后增强转录因子STAT3的磷酸化并促进其入核,入核后能够直接结合到UCHL3的启动子区域并促进UCHL3的转录和表达。5.Pacritinib药物能够逆转TP53突变结直肠癌高水平糖酵解及5-FU化疗耐药。结论:1.Pacritinib能够通过抑制TP53突变结直肠癌的JAK2-STAT3通路进而抑制UCHL3和ENO1表达。2.结直肠癌野生型P53功能的缺失及突变型P53的激活均能通过活化JAK2-STAT3通路进而促进UCHL3和ENO1的表达,而使用Pacritinib药物治疗能够逆转这一过程。3.Pacritinib可以抑制TP53突变结直肠癌糖酵解及增强5-FU化疗敏感性。