目的:在“脾失健运,痰瘀互结”理论指导下,联合网络药理学及16s r DNA测序分析TLR-4/My D88/NF-κB通路可能与化瘀祛痰方干预AS肠黏膜损伤的潜在机制密切相关,进而采用动物实验通过高脂喂养Apo E~(-/-)小鼠构建AS模型,及细胞实验LPS刺激猪小肠上皮IPEC-J2细胞构建炎症损伤模型,探讨化瘀祛痰方对AS肠道菌群及肠黏膜屏障的影响及机制。材料与方法:实验一:基于“脾失健运,痰瘀互结”理论探讨健脾祛痰化瘀法调控肠道菌群防治动脉粥样硬化的理论研究。实验二:以化瘀祛痰方的作用靶点与AS及肠黏膜损伤的靶点取交集,获取化瘀祛痰方治疗AS肠黏膜损伤的潜在治疗靶点,并绘制疾病、药物、靶基因网络图,构建PPI网络,并进一步筛选关键靶点,得到获取生物学过程、细胞组分、分子功能和细胞信号通路。实验三:40只Apo E~(-/-)小鼠和10只C57BL/6 J小鼠适应性饲养1周后,Apo E~(-/-)小鼠按随机数字表法分组,给予高脂饲料喂养进行模型复制。中药治疗组按人与小鼠体表面积比换算给药等效剂量,从造模成功第1天开始,每日1次灌胃,连续给药30天。分为正常对照组、模型组、化瘀祛痰方组。16s r DNA测序分析小鼠肠道菌群变化包括:有效数据统计及优质序列分布;OTU聚类结果;构建稀释性曲线;Shannon-Wiener曲线;Specaccum物种累积曲线;各组小鼠肠道菌群组成和Alpha多样性分析;主成分分析(PCA分析);NMDS分析;基于Uni Frac的heatmap;各组小鼠肠道菌群物种组成结构差异性分析。实验四:将10只C57BL/6 J小鼠为正常组,40只Apo E~(-/-)小鼠分为模型组、中药低、中、高剂量组;模型制备与实验三相同。HE染色评估肠黏膜屏障病理损伤程度;ELISA法检测各组小鼠血清及盲肠内容物中LPS水平;免疫组化法检测各组小鼠肠组织ZO-1、Claudins、Occludins表达情况;Western Blot法检测各组小鼠肠组织ZO-1、Claudins、Occludins及WES全自动蛋白定量检测TLR-4、My D88、NF-κB蛋白表达水平;Realtime RT-PCR法检测各组小鼠肠组织ZO-1、Claudins、Occludins、TLR-4、My D88、NF-κB m RNA的表达水平。实验五:将细胞分为正常对照组:IPEC-J2细胞;模型组:50ug/ml LPS+IPEC-J2细胞;中药含药血清组:50ug/ml LPS+IPEC-J2细胞+大鼠中药含药血清;抑制剂组:50ug/ml LPS+IPEC-J2细胞+大鼠中药含药血清+TLR-4抑制剂(TAK-242)。MTS对细胞活力的影响;不同浓度LPS对CLND1及TJP1的影响;免疫荧光检测各组细胞ZO-1蛋白表达情况;q RT-PCR法检测细胞中TLR-4、My D88、NF-κB、ZO-1、Claudin-1、Occludin m RNA的水平;Western Blot法检测细胞中TLR-4、My D88、NF-κB、ZO-1、Claudin-1、Occludin蛋白水平。结果:实验一:在AS中医病机“脾失健运,痰瘀互结”指导下,深入探讨健脾祛痰化瘀法调控肠道菌群防治动脉粥样硬化的机制,有助于进一步阐明“痰瘀论治”动脉粥样硬化科学内涵。实验二:在TCMSP及BATMAN-TCM中收集到化瘀祛痰方113个有效成分,412个对应靶点;化瘀祛痰方潜在靶点与AS相关靶点和肠黏膜损伤相关靶点的交集后,得到192个交集基因;构建“化瘀祛痰方-有效成分-AS-肠黏膜损伤”网络,蛋白质相互作用网络关系、GO基因功能本体富集分析、KEGG通路富集分析得到条目2827条,以及富集到174个通路。实验三:1.各组小鼠16s菌群稀释性曲线结果:各组Bemcentinib作用的曲线趋向平坦,说明测序数据量合理、可靠;Shannon-Wiener曲线结果在20000 Reads水平时曲线趋向平坦,所有样本均进入平台期,说明本研究测序数据量足够大,能够充分反映所测样本微生物学信息;2.Specaccum物种累积曲线结果:说明此次研究样本量充足,可以对Alpha多样性进行分析;各组小鼠肠道菌群组成和Alpha多样性分析,与正常对照组相比,模型组OTUs和Chao1指数明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与模型组相比,化瘀祛痰方组的OTUs和Chao1指数显著降低,Shannon和Simpson指数升高,差异具有统计学意义(P<0.01);主成分分析(PCA分析)说明组间具有差异性;NMDS分析说明组内微生物差异较小,组间差异较大;基于Uni Frac的heatmap显示各组之间Beta多样性比较呈现差异,对照组与化瘀祛痰方组矩阵距离较近,相似度较高,Beta多样性呈现差异度减少趋势;而模型组与其他两组比较,矩阵距离较远,呈现Beta多样性显著差异;3.各组小鼠肠道菌群物种组成结构差异性分析显示:厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetesother)仍是各组小鼠肠道菌群的主要成分。比较各组小鼠盲肠内容物中这几种门分类水平的细菌比例,模型组厚壁菌门及放线菌门比例升高,拟杆菌门及变形菌门的比例降低;与模型组相比,化瘀祛痰方干预后厚壁菌门及放线菌门比例有所降低,拟杆菌门及变形菌门有所升高;LDA Effect Size分析结果可见,正常对照组丰度有差异的物种为:f-Bacteroidale-S24-7-group、普雷沃氏菌科(f-Prevotellaceae)、拟杆菌目(o-Bacteroidales)、拟杆菌纲(c-Bacteroidia)、乳杆菌科(f-Lactobacillaceae)、瘤胃菌科(f-Ruminococcaceae);模型组丰度有差异的物种为:毛螺菌属(f-Lachnospiraceae)、梭菌目(o-Clastridiales)、梭菌属(c-Clastridia)、脱硫弧菌科(f-Desulfovibrionaceae)、脱硫弧菌目(o-Desulfovibrionales);化瘀祛痰方组丰度有差异的物种为:拟杆菌科(f-Bacteroidaceae)、葡萄球菌科(f-Staphylococcaceae)、芽孢杆菌目(o-Bacillales)、肠球菌科(f-Enterococcaceae)、乳杆菌目(o-Lactobacillales)、杆菌(c-Bacilli)、肠杆菌科(f-Enterobacteriaceae)、肠杆菌目(o-Enterobacteriales)、γ-变形菌纲(c-Gammaproteobacteria)。论文四:1.病理形态学结果:正常对照组小鼠肠上皮组织结构完整,黏膜层未见明显损伤,上皮细胞排列紧密;模型组小鼠肠上皮可见大片绒毛脱落,固有层裸露;化瘀祛痰方低剂量组染色可见上皮下间隙增宽,上皮层与固有层分离,伴有少量绒毛脱落;化瘀祛痰方中剂量组可见绒毛顶端上下皮间隙稍增宽;化瘀祛痰方高剂量组上皮下间隙稍增宽,上皮层与固有层稍分离;2.各组小鼠盲肠内容物、血清LPS水平结果:与正常对照组相比,模型组小鼠血清及盲肠内容物中LPS的水平显著下降(P<0.01);与模型组比较,化瘀祛痰方中剂量及高剂量组小鼠血清、盲肠内容物中LPS的水平显著降低(P<0.05或P<0.01);3.各组小鼠肠组织炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平结果显示:与正常对照组相比,模型组肠组织TLR-4、My D88、NF-κB蛋白的表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,化瘀祛痰方低、中、高剂量组TLR-4、My D88、NF-κB蛋白的表达显著降低(P<0.01);4.免疫组化检测各组小鼠肠组织ZO-1、Occludin、Claudin1蛋白表达与正常对照组相比,模型组肠组织中ZO-1、Occludin、Claudin1蛋spatial genetic structure白的表达显著降低;与模型组比较,化瘀祛痰方低、中、高剂量组ZO-1、Occludin、Claudin1蛋白的表达显著升高;5.各组小鼠TLR-4/My D88/NF-κB通路相关蛋白及m RNA的表达各组小鼠肠组织TLR-4、My D88、NF-κB蛋白表达比较结果显示:与正常对照组相比,模型组肠组织中TLR-4、My D88、NF-κB蛋白的表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,化瘀祛痰方低、中、高剂量组TLR-4、My D88、NF-κB蛋白的表达显著降低(P<0.01);各组小鼠肠TLR-4、My D88、NF-κB m RNA水平比较结果显示:与正常对照组相比,模型组肠道组织中TLR-4、My D88、NF-κB m RNA的表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,化瘀祛痰方低、中、高剂量组TLR-4、My D88、NF-κB蛋白的表达显著降低(P<0.01)。6.各组小鼠肠上皮细胞间紧密连接蛋白相关蛋白及m RNA的表达各组小鼠肠ZO-1、Occludin、Claudin1蛋白表达比较结果显示:与正常对照组相比,模型组肠道组织中ZO-1、Occludin、Claudin1蛋白的表达显著下降(P<0.01);与模型组比较,化瘀祛痰方低、中剂量组ZO-1及化瘀祛痰方中剂量组Occludin、Claudin1蛋白的表达显著升高(P<0.01);各组小鼠肠ZO-1、Occludin、Claudin1 m RNA水平比较结果显示:与正常对照组相比,模型组肠组织中ZO-1、Occludin、Claudins m RNA的表达显著下降(P<0.01);与模型组比较,化瘀祛痰方低、中剂量组ZO-1及化瘀祛痰方中剂量组Occludin、Cludins m RNA的表达显著升高(P<0.01)。论文五:1.CCK8筛选LPS(10ug/ml、50ug/ml)干预IPEC-J2细胞24h,MTS筛选结果显示,50μg/m L LPS为刺激CLDN1和TJP1的最佳剂量;2.各组细胞上清液及细胞中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平结果显示,与正常对照组比较,模型组IL-6、IL-1β、TNF-α水平明显升高(P<0.05);与模型组相比,空白含药血清组IL-6、IL-1β、TNF-α水平无明显差异(P>0.05),中药含药血清组IL-6、IL-1β、TNF-α水平明显降低(P<0.05);3.免疫荧光检测各组细胞紧密连接蛋白ZO-1的分布结果显示,与正常对照组比较,模型组紧密连接蛋白ZO-1表达明显降低,与模型组比较,中药含药血清组及抑制剂组紧密连接蛋白ZO-1表达明显升高,与中药含药血清组比较,抑制剂组紧密连接蛋白ZO-1表达明显降低;4.各组细胞TLR-4/My D88/NF-κB通路相关蛋白肠上皮细胞间紧密连接蛋白及m RNA的表达与正常对照组相比,模型组细胞中TLR-4、My D88、NF-κB表达显著上升,ZO-1、Occludin、Claudins m RNA的表达显著下降(P<0.01);与模型组比较,中药含药血清组及抑制剂组的TLR-4、My D88、NF-κB表达显著下调,Occludin、Cludins m RNA的表达显著升高(P<0.05或0.01);与正常对照组相比,模型组细胞中TLR-4、My D88、NF-κB表达显著上升,ZO-1、Occludin、Claudins m RNA的表达显著下降(P<0.01);与模型组比较,中药含药血清组及抑制剂组的TLR-4、My D88、NF-κB表达显著下调,Occludin、Cludins m RNA的表达显著升高(P<0.05或0.01)。结论:1.化瘀祛痰方对Apo E~(-/-)AS小鼠肠道菌群紊乱具有纠正作用。2.化瘀祛痰方对Apo E~(-/-)AS小鼠肠黏膜屏障损BYL719纯度伤具有保护作用。3.化瘀祛痰方通过调控TLR-4/My D88/NF-κB通路抑制炎症反应改善AS状态下肠黏膜屏障损伤。