背景:金黄色葡萄球菌是引起假体周围感染(Periprosthetic joint infection,PJI)的主要病原体,常导致患者关节功能丧失和病灶迁延不愈。巨噬细胞对金黄色葡萄球菌的先天免疫反应至关重要,能够通过内吞作用实现对其的清除。然而,细胞内的金黄色葡萄球菌能够触发半胱天冬酶11(Caspase-11)的激活来劫持巨噬细胞的线粒体,解耦线粒体衍生的活性氧(Mitochondrion-derived reactive oxygen species,mROS)防御机制,从而抑制mROS介导的巨噬细胞胞内杀菌作用,使金黄色葡萄球菌能够实现在巨噬细胞内的免疫逃逸,导致PJI。鉴于巨噬细胞独特的效应功能和对细菌的趋化性,我们构建了表面经巨噬细胞靶向肽修饰的多肽纳米系统,负载含有金黄色葡萄球菌特异性嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)和 caspase-11 短发夹 RNA(CASP11 shRNA)复合基因的质粒。通过表面沉积的形式在植入物表面形成负载多肽纳米粒和硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)的涂层,原位编辑体内的巨噬细胞,在植入物周围形成杀菌性超级嵌合抗原受体巨噬细胞(Super CAR-macrophages),实现对金黄色葡萄球菌高效的靶向、吞噬和胞内清除。同时,缓释的HS能够促进成骨,精确匹配骨再生过程,在骨-植入物界面实现高效的骨整合。目的:本研究通过正负电荷相互吸引的层层组装原理,将多肽纳米粒和HS负载于钛植入物表面以制备纳米涂层,并通过体外、体内实验系统研究了该涂层同步预防PJI及促进假体周围骨整合的能力。方法:1.采用固相肽合成技术合成多肽序列,并通过质谱和高效液相色谱验证多肽的合成是否成功。2.将多肽和质粒通过溶液自组装合成多肽纳米粒(DNA-laden peptide nanoparticle,pPNP),通过粒径电位测定仪和透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)证明pPNP的制备是否成功。3.利用聚赖氨酸(Poly-L-lysine,PLL)溶液与含有pPNP和HS溶液的正负电荷相互作用,使PLL、pPNP以及HS在钛植入物表面层层沉积,制备自组装纳米涂层(pPNP coating on implant,Ti-pPNP)。通过扫描电镜(Scanning electron microscopy,SEM)、原子力显微镜(Atomic force microscopy,AFM)及X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscFer-1opy,XPS)证明钛植入物表面Ti-pPNP的制备是否成功。4.利用吞菌实验、细菌与线粒体共定位实验、细菌涂板定量实验,评估super CAR-macrophages的体外抗菌性能。同时利用实时定量PCR(RT-PCR)与成骨因子免疫荧光实INCB018424使用方法验,评估Ti-pPNP涂层体外成骨分化性能。5.建立小鼠植入物感染模型,利用细菌涂板定量实验、组织病理学分析、酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、流式细胞学和 micro-CT 等实验分析,评估Ti-pPNP体内抗菌和促成骨性能。结果:质谱测定结果显示与两亲性肽单体的分子量一致;高效液相色谱结果显示合成的两亲性肽单体纯度达到要求;上述结果均证明了两亲性肽单体的成功制备。pPNP在TEM下显示出明确的球形结构;粒径电位测定仪结果显示pPNP平均直径为108.5 nm且zeta电位为-21 mV;上述结果证明了 pPNP的成功制备。SEM观察到pPNP涂层显示出良好的均一性;从AFM的形态评估分析中获得了类似的结果,并且还发现pPNP涂层的平均粗糙度和峰谷粗糙度显着降低;同时XPS显示的pPNP涂层与对照组相比N 1 s、C 1 s和S2p峰明genetic disoders显改变;上述结果证明了 Ti-pPNP涂层制备成功。吞菌实验显示pPNP组细菌大量内化;细菌与线粒体共定位实验显示pPNP组线粒体与细菌共定位比率高;细菌涂板定量实验显示pPNP组细菌大量减少;上述结果共同证明了super CAR-macrophages优异的体外抗菌性能。RT-PCR分析结果显示,在Ti-pPNP涂层表面培养的间充质干细胞成骨相关基因的表达上升最明显,上述结果证实了钛植入物表面纳米涂层良好的体外促成骨分化能力。体内实验中,细菌涂板定量实验显示Ti-pPNP组细菌大量减少;术后2周的骨组织H&E(Hematoxylin and eosin)染色显示Ti-pPNP组无明显的骨感染现象、革兰氏染色显示无细菌残留、ELISA与流式结果显示Ti-pPNP组扭转了局部的免疫抑制环境;术后4周的骨组织masson染色、番红固绿染色和micro-CT分析结果显示Ti-pPNP组植入物周围有大量的新生骨组织,上述结果共同表明,Ti-pPNP涂层在体内同样具有良好的抗感染、恢复局部免疫及促成骨能力。结论:1.成功制备了两亲性肽单体、多肽纳米粒以及钛植入物表面的纳米涂层。2.该纳米涂层在体内、体外均具有良好的抗感染及促成骨性能。3.该纳米涂层制备简单可行,可能会为未来关节置换术后预防假体周围感染及促进骨整合提供一个切实可行的方案。