第一部分背景椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration,IVDD)是临床上引起腰痛的主要原因之一。对于IVDD引起的疼痛,临床上以药物为主的保守治疗和以手术为主的综合治疗为主,但两者均不能彻底解决腰痛带来的影响。近年来,对椎间盘退变的生物学治疗的研究逐渐增多,并取得了一定成果。尤其是近年来间充质干细胞用于椎间盘的生物治疗。我们团队前期对功能化自组装多肽凝胶支架RADKPS的生物支架结构及相关生物修复作用进行了一系列的实验。但对于RADKPS对椎间盘退变的具体修复机制尚未完全阐明,本研究将探讨RADKPS水凝胶与髓核间充质干细胞焦亡之间的关系,并阐明可能的分子机制。目的:1.建立脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对髓核间充质干细胞(Nucleus pulposus mesenchymal stem cells,NPMSCs)焦亡的模型;2.探索ERK1/2和RhoA信号通路在NPMSCs中的表达情况;3.探讨ERK1/2和RhoA信号通路抑制剂PD98059和CCG-1423对RADKPS作用后NPMSCs的影响;方法:采用差速贴壁法分离人NPMSCs,流式细胞术进行干细胞表型鉴定,三系分化能力测定。RADA16-1与RADKPS成胶性能观察,通过CCK-8法检测RADKPS对NPMSCs增殖能力的影响。通过免疫组织化学分析人正常椎间盘组织和退变椎间盘组织ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达。通过实时定量PCR及WB实验评估LPS作用后NPMSCs基质的变化,焦亡蛋白的表达情况,对潜在信号通路ERK1/2和RhoA的影响。接着评估RADKPS作用后NPMSCs焦亡蛋白及信号通路蛋白表达的影响,并通过加入信号通路抑制剂PD98059和CCG-1423评估对信号通路蛋白及RADKPS加入后的影响。结果:经分离传代至P3代的NPMSCs在显微镜下呈纺锤状长梭形,实时定量PCR实验证实,LPS促进了焦亡相关基因IL-1β的表达(p<0.001),并下调了细胞外基质(ECM)相关基因sox-9的表达(P<0.001)。通过免疫组化分析,退变椎间盘组织中ERK1/2和P-ERK1/2的表达降低。我们从二维培养和三维培养的角度评估了 RADKPS对NPMSCs增殖CH-223191配制能力的影响。我们发现RADKPS可以促进NPMSCs在二维和三维培养中的增殖。WB实验表明,RADKPS抑制焦亡相关蛋白的表达,促Cells & Microorganisms进p-ERK1/2(p<0.001)和 RhoA(p<0.01)的表达,并促进Ⅱ型胶原(p<0.01)和 sox-9(p<0PLX-4720分子量.01)表达,PD98059 和 CCG-1423 抑制其表达。结论:这项研究表明,RADKPS水凝胶通过ERK1/2和RhoA信号通路有效地保护NPMSCs免于焦亡。结果还表明,RADKPS以时间依赖的方式促进NPMSCs的增殖,并可以在三维培养的水凝胶模型中保护NPMSCs免受LPS介导的焦亡。因此,RADKPS水凝胶可作为椎间盘退变的潜在治疗方法。第二部分背景前期的实验已经证实,RADKPS水凝胶通过抑制焦亡减轻NPMSCs损伤,这是通过抑制程序性死亡诱发的炎症改变来达到治疗椎间盘退变的目的。从细胞自身的潜能来看,其自我修复的能力并未得到改善。自噬是一种潜在的细胞的自我保护机制,细胞的适度自噬有利于细胞的恢复和生长。本章就RADKPS水凝胶与NPMSCs自噬之间的关系进行探讨,并探索其可能的分子机制。目的:探索RADKPS和NPMSCs自噬的关系探索RADKPS长期的释放节律探讨RADKPS与自噬之间可能的信号通路及分子机制方法:分离人原代NPMSCs,观察传代细胞形态及生长状态。干细胞分化能力鉴定,水凝胶溶解与释放实验探明RADA16-1和RADKPS释放节律及缓释效应比较。细胞增殖实验探索血清饥饿、AKT信号抑制剂LY294002及RADKPS对NPMSCs的增殖能力的影响。实时-定量PCR检测RADKPS对自噬相关基因p62的表达影响。WB实验评估血清饥饿、IL-1β及3%DMSO作用后对NPMSCs自噬的影响。RADKPS作用后,对NPMSCs自噬的影响,及对AKT信号通路的影响。结果:培养至P3的NPMSCs具有良好的成脂、成骨及成软骨分化能力。经过溶解与释放实验1天、3天和7天后,RADA16-1平均释放率为0.3450、0.5197和0.6972,RADKPS平均释放率为0.1163、0.3902和0.5001。通过统计学检验,RADKPS缓释效率比RADA16-1在1天、3天和7天3个时间点均能具有统计学意义。这说明RADKPS对药物的储存效率更高。CCK-8实验显示RADKPS水凝胶能够促进NPMSCs增殖,并减轻血清饥饿效应对NPMSCs的损伤。经过实时-定量PCR显示RADKPS抑制p62 mRNA的表达。WB实验证实,与10ng/ml IL-1 β和3%DMSO相比,1%FBS、0%FBS 和 10 μmol/L 雷帕霉素(Rapamycin)能够诱导 NPMSCs 自噬。但1%FBS同时上调凋亡蛋白Bax的表达,自噬激活剂Rapamycin降低Bax表达,自噬抑制剂3-MA逆转这种改变,增加Bax表达。与Rapamycin一样,RADKPS水凝胶能够促进自噬相关的蛋白Beclin-1表达,并促进p-AKT蛋白表达,AKT信号通路抑制LY294002抑制p-AKT的表达,并能抑制Beclin-1表达。这表明AKT信号通路可能参与NPMSCs自噬的过程。结论:RADKPS水凝胶具有良好的缓释药物的功能,显著增加BMP-7核心片段(KPSS)的半衰期,增加药物发挥作用时间。RADKPS水凝胶能减轻血清饥饿对NPMSCs造成的损伤。RADKPS水凝胶能够促进NPMSCs自噬,这种作用可能与AKT信号通路的激活有关。