癌症是威胁人类健康的主要疾病之一,具有早期不易发现和中晚期难以治疗的特点,发病后往往给患者的身心造成巨大伤害。尽管近年来在外科手术治疗、放射线治疗、靶向药物治疗和免疫治疗等方面取得了一些进展,但其治疗效果仍远不能满足患者的需求。因此,不断探索和创新癌症的治疗方法仍具有重大的现实意义和社会价值。癌症的本质原因是原癌细胞基因的突变,从基因角度研究癌症的治疗方法具有重要意义。作为一种强有力的基因编辑工具,CRISPR基因编辑系统已广泛应用于促癌/抑癌基因、癌症模型构建和癌症诊断等领域的研究。然而,当前利用CRISPR直接对癌细胞进行杀伤的研究还相对较少。即使当前有限的研究,也主要集中在利用CRISPR破坏癌细胞表达功能性蛋白的外显子上。这种杀伤策略的有效性会受到CRISPR编辑效率和癌症异质性的限制。CRISPR在直接杀伤癌细胞方面的研究相对较少,是因为面临着以下难点:如何特异性地编辑癌细胞而不影响正常细胞;如何将CRISPR系统高效地、特异性地递送到癌细胞内;如何在保证编辑特异性和递送特异性的前提下,提高CRISPR系统在癌细胞内的编辑效率。本文聚焦于利用CRISPR直接杀伤肿瘤细胞这一主题,致力于解决上述难题,以期为肿瘤治疗提供新的思路和方法。本研究以人类基因组中非编码区最大的重复序列——Alu序列Medical toxicology为编辑目标,利用CRISPR剪切癌细胞基因组中广泛分布的Alu重复序列。通过这种方法,使癌细胞染色体产生海量断裂,整体破坏癌细胞基因组DNA,最终杀死癌细胞。这项研究为探索新的癌症治疗方法提供了一条新的思路。本文主要在以下四个方面开展了研究:1.Alu一致序列的筛选与确定Alu序列是人类基因组中一种重要的重复序列,伴随人类的漫长演化历程,可以细分为多个亚家族。这些亚家族的一致序列存在一定的差异,因此需要从中选择一个合适的Alu一致序列作为CRISPR系统的攻击靶标。为了寻找合适的Alu一致序列,本研究使用了BLAST方法在不同家族的Alu一致序列在人类基因组GRCh38.p14中的分布进行了检索。实验结果表明,由位置频率矩阵统计得到的Alu一致序列大量且广泛地分布于人类细胞每一根染色体上,相对于其他家族的Alu一致序列,更适合作为破坏基因组DNA的CRISPR剪切靶标。2.胞外剪切Alu一致序列对基因组DNA的损伤为了探究CRISPR系统对Alu一致序列的剪切是否会破坏基因组DNA,我们进行了细胞外切割实验。实验中使用了Cas12a核酸内切酶和靶向Alu序列的cr RNA,分别对Alu一致序列的DNA片段、Alu一致序列的PCR扩增产物、HEK-293T细胞基因组DNA、五种癌细胞基因组DNA和五种不同生物的基因组DNA进行切割。同时,我们还对比了切割Alu一致序列和切割单拷贝基因对基因组DNA的破坏程度。实验结果表明,CRISCobimetinib体内PR可以切断Alu一致序列的DNA片段,并且可以切断癌细胞扩增所得的Alu序列。此外,我们发现CRISPR对Alu一致序列的剪切会导致人类基因组DNA的完全降解,并且可以完全消化五种癌细胞的基因组DNA。然而,这种剪切造成的破坏仅限于含有Alu序列的人类基因组DNA。相比之下,剪切单拷贝基因对基因组DNA的破坏并不明显。实验结果证明了CRISPR系统对Alu一致序列的剪切可以破坏基因组DNA,并且这种破坏主要局限于含有Alu序列的人类基因组DNA。3.胞内切割Alu一致序列对癌细胞毒性的考察为了研究在细胞内剪切Alu一致序列对基因组DNA的破坏以及剪切所产生的细胞毒性,我们将剪切Alu序列的CRISPR系统克隆至质粒并整合绿色荧光蛋白报告系统,然后使用Lipofectamine 3000将质粒转染至HEK-293T等细胞。对转染后的细胞进行荧光镜检、流式细胞术统计和细胞毒性分析,以考察被剪切Alu序列后的细胞的生理状况。此外,我们还使用免疫荧光表征了剪切Alu序列后产生的大量DNA双链断裂现象。为了提高CRISPR系统的递送水平,我们将切割Alu一致序列的CRISPR系统包装至Ad5重组腺病毒。实验结果显示,传统的编辑单拷贝基因杀伤癌细胞的方法会使少量细胞逃脱基因编辑带来的不利影响,进而存活下来并再次增殖,而Cselleck MDV3100RISPR对Alu重复序列的剪切使细胞难以存活和继续增殖。此外,我们发现剪切Alu一致序列的不同位点和使用不同的Cas酶会造成不同的细胞毒性。免疫荧光分析显示,剪切Alu一致序列使癌细胞产生大量的DNA双链断裂。以腺病毒为载体递送CRISPR系统至癌细胞提高了转导效率。此外,我们将表达Cas12a蛋白的元件和cr RNA的元件包装至不同的重组Ad5腺病毒进行转导,既降低了生物安全风险,又保证了较高的共感染效率及细胞毒性。这些实验结果证明了在细胞内剪切Alu一致序列可以破坏基因组DNA并产生显著的细胞毒性。4.特异性剪切癌细胞Alu一致序列的CRISPR系统的设计和优化为了特异性地靶向癌细胞进行Alu序列的剪切,本文提出了一种基于甲胎蛋白(Alpha-Fetoprotein,AFP)启动子和位点特异性重组酶的CRISPR编辑系统,并对其进行了设计和优化。甲胎蛋白启动子是一种肿瘤特异性启动子,本文以甲胎蛋白阳性的肝癌细胞系为研究对象,比较了不同结构的甲胎蛋白启动子驱动CRISPR-Cas12a表达的效率,并选择了最优的甲胎蛋白启动子p AFP(a2b)进行后续实验。通过结合位点特异性重组酶和串联终止子元件,本文构建了多种肝癌细胞内特异性表达CRISPR系统的模型,并对其特异性和杀伤效率进行了评估。实验结果表明,本文成功构建了一种兼具表达特异性和高表达效率的双重组腺病毒系统,实现了对多种AFP阳性肝癌细胞的靶向杀伤。基于m CMV启动子、甲胎蛋白启动子、位点特异性重组酶和串联终止子元件构建的双重组腺病毒系统,在表达特异性上,与使用纯甲胎蛋白启动子的系统持平;在表达效率上,达到了纯m CMV启动子系统的74.5%。此项研究打破了以往CRISPR系统仅限于编辑外显子基因位点以消灭癌细胞的框架。实验结果显示,剪切Alu重复序列相较于剪切单拷贝基因,能更有效地提高CRISPR杀死癌细胞的功效。在递送方式上,本研究运用了双重组腺病毒系统,既确保了安全性,又显著提升了传递效率,超越了脂质体转染法。特别值得一提的是,本项研究提出了肿瘤特异性启动子与位点特异性重组酶配合使用的创新构架,从而在表达效率和表达的特异性上都取得了显著的提升。总之,这项研究提供了一种全新的从基因层面治疗癌症的创新策略,通过高效破坏癌细胞基因组,为癌症的治疗前景带来了新的希望。